猪瘟单克隆抗体ELISA

一、材料及试剂

1、猪瘟单抗纯化抗原

2、兔抗猪IgG酶标抗体

3、猪瘟阳性血清

4、猪瘟阴性血清

1～4均由指定的生物制品所购买。

5、ELISA反应板

6、包被液

碳酸钠 1.50g

碳酸氢钠 2.93g

H2O加至 1 000ml

pH值9.6

7、PBS液

氯化钠 8.90g

磷酸二氢钾 0.20g

无水磷酸氢二钠 2.13g

加双馏水 1 000ml

8、PBS－吐温洗涤液

PBS液 1 000ml

犊牛血清 5ml

混合即可

9、底物溶液

⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液

柠檬酸 21g

双蒸馏水加至 1 000ml

⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4·12H2O 71.6g

双蒸馏水 加至 1 000ml

⑶ pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液

取⑴液 24.30ml

⑵液 25.70ml

混匀即可

⑷邻苯二胺液

取⑶液 50ml

双馏水 50ml

磷苯二胺 20mg

30%H2O2 0.15ml

待邻苯二胺溶化后再加H2O2，现用现配。

10、终止液

浓H2SO4(98%) 22.2ml

H2O 177.80ml

二、操作方法

1、用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被100µl，4℃湿盒过夜。

2、次日取出，甩去孔内液体，3×3′冲洗。

3、将待检血清以PBS液做400倍稀释，每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释，于对照孔中加100μl.37℃温育1.5h～2h。

4、重复第二步，取出，甩去孔内液体，3×3′洗涤。

5、将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育1.5h～2h。

6、重复第4步。

7、每孔加底物溶液100µl，室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。

8、每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。

三、结果判定

在猪瘟弱毒酶联板上，OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。

在猪瘟强毒酶联板上，OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟强毒抗体阴性。