酶免疫细胞化学染色操作大全

一、材料与试剂

1.  玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。

2.  5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。

3.  3%牛血清白蛋白(BSA)，用PBS配。

4.  0.01M pH7.4 PBS

5.  1% BSA-PBS(含0.05% Tween20)

6.  AEC底物

（1）底物缓冲液(20X) PH 4.6

醋酸(分子量60.6) 30.6 ml

Triton X-100

醋酸钠 3H₂O(分子量136.1)66.68克

加蒸馏水到960 ml，调pH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000 ml。

（2）AEC(20X)

AEC 15 mg/ml，溶在DMF(二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH₃)₂ 分子量73.10中)

（3）0.6% H₂O₂(20X)

临用时，（1）（2）（3）各50 ul，在1 ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。

7.  DAB(即DAB-4HCL)

（1）1.5克DAB在100 ml水溶液中(20X)

（2）1M Tris(20X)，用HCl调PH到7.4

（1）（2）各滴加入1 ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。溶解后(可加热到50 ℃)，加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4)，枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或400 ℃保存。

8.  苏木素复染液

苏木素 1克

碘酸钠 0.2克

钾矾 50克

水 1000 ml

9.  含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。

10.  3% H₂O₂：30%H₂O₂1份，加9份双蒸水，临用时配。

11.  细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板

12.  封片液：1克明胶，溶于30 ml 35 ℃水中，加入35 ml甘油(或用甘油封片)和650 mg石碳酸(先溶于0.6 ml水中)。

二、细胞内源过氧化物酶阻断(使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断)

1.  从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或37 ℃ 10-15分钟，使恢复温度。

2.  加3% H₂O₂，细胞片20 ul/孔，培养板100 ul/孔，使充分覆盖住细胞。

3.  室温10分钟后，甩掉 H₂O₂，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。

三、封闭

细胞片用5-10%正常山羊血清(20 ml/孔)，细胞板用2-5%BSA(PBS配制)100 ul/孔，置37 ℃孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。

四、免疫化学染色

1.  分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20 ul/孔，细胞板50 ul/孔，使充分覆盖细胞。37 ℃1小时或4 ℃冰箱过夜;

2.  弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗(最好在慢速摇床上)3-5分钟，转入第二杯PBS(100 ml)，如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次;

3.  加SP试剂(SP法，即放大法)

(1)加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10 ul/孔，细胞板50 ul/孔，使充分复盖细胞。37 ℃孵育30分钟;

(2)按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干;

(3)加已优选好浓度的SP试剂，用量同“(1)”，37 ℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干;

4.  间接法加二抗(不放大法)

方法同SP法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略(3)步骤;

5.  加底物显色

(1)加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20 ul/孔，细胞培养板50 ul/孔，置于37 ℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果(阳性对照显色程度为“+++” )，用自来水即可终止反应;

(2)复染：苏木素染液(使用时间最好不超过两个月)加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝，最后在蒸馏水中漂洗。

6.  封片

洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。

五、结果判断

阳性——诱导细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导阳性细胞(1-30%);阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色(排除边缘效应)

六、注意事项

1.  一抗、二抗的稀释采用1% BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS;

2.  整个反应过程在湿盒中进行(细胞片);

3.  洗涤时应使用染色缸(细胞片);

4.  对照系统，必须要做的对照系统：阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清;阴性对照：

（1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液;

（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照：空白对照：不加一抗，用1%BSA替代;无关对照：与本项目无的第一抗体。