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        在大肠杆菌(E.Coli)表达蛋白产物

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        一、原理
        1、 E . coli 表达系统
        E . coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E . coli 菌株以后,通过温度的控制,诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质,将表达样品进行SDS-Page 以检测表达蛋白质。
        2、 外源基因的诱导表达
        提高外源基因表达 水平的基本手段之一,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔(IPTG)诱导外源基因表达。
        不同的表达质粒 表达方法并不完全相同,因启动子不同,诱导表达要根据具体情况而定。

        二、材料
        1、诱导表达材料
        ( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基
        酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
        NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%
        蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
        适用范围:大肠杆菌
        ( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。
        ( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:
        50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
        50 mmol / L DTT
        2 % SDS (电泳级)
        0.1 % 溴酚蓝
        10 % 甘油
        2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
        1 )酶溶法
        (1)裂解缓冲液:
        50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
        1 mmol / L EDTA
        100 mmol / L NaCI
        (2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。
        (3)10 mg / mL 溶菌酶。
        (4)脱氧胆酸。
        (5)1 mg / mL DNase I。
        2 )超声破碎法
        ( 1 ) TE 缓冲液。
        ( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:
        100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
        100 mmol / L DTT
        4 % SDS
        0.2 % 溴酚蓝
        20 % 甘油
        三、实验方案
        1、外源基因的诱导表达
        ( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
        ( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。
        ( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定,
        确定无误后进行下一步。
        ( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
        ( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。
        2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
        1 )细菌的裂解
        常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

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