GST-pulldown检测已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用操作流

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实验目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST(Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH(Glutathione)亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱 时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

试剂：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分装)，PMSF(Amersco)，Cocktaier(Merck 539134)，Immobilized Glutathione(PIERCE 15160)

实验操作程序：

材料及试剂

探针 蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物

细胞蛋白裂解液，洗脱液：

PBS 及PBS+1%Triton-100

PBS (1L)

NaCl： 8g

KCl： 0.2g

Na2HPO4： 1.44g

KH2PO4： 0.24g

加入800ml蒸馏水，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌!4℃保存备用!

PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM，将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可!保持于-20℃或者4℃

(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)

1：原核融合蛋白A的获得

1.1：将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株

1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37℃培养过夜

1.3：将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37℃，225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整)，6000g，10分钟，4℃离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20℃放置O/N

1.4：室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF)，吹打混匀

1.5：冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。至裂解液充分清凉

1.6：11000rpm，15分钟，4℃离心分离上清， -80℃保存备用

2：真核融合蛋白B的获得

2.1：将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白(如HA,或者myc)的真核表达载体上，进行细胞转染

3：48小时后，取适量融合蛋白GST-A冰上冻融

4：取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次，将冻融融合蛋白GST-A与之混匀，4℃层析柜旋转结合1小时。

5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul( PBS+Beads)作Offer。

6：同时，裂解真核融合蛋白B，去尽培养基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液(以6well为例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier)，4℃放置30分钟。

7：吹打收集至1.5mlEP管，超声破碎。13000rpm，15分钟，4℃离心取上清。

8：BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer，其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中，用PBS补足液体到600ul左右，以便蛋白之间能充分结合!4℃旋转结合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分钟，高速离心，Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。