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        原核表达蛋白会出现包涵体,蛋白难以复性,那用真核表达蛋白要如何操作?

        相关实验:大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的制备实验

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        哎呀哎呦薇

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        2 个回答

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        天一湖医者

        有帮助

        在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般趋向于使用分泌表达载体,以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达,如一些胞质蛋白,非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽,也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。

        1、克隆

        选用合适 的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体,则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。

        2、重组栽体线性化

        重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高,环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体

        pPC19选用BgiⅡ线性化,转化后可得到Muts表型转化子;选用SaI或StuI线性化,转化后可得到Mut表型转化子。

        3、转化

        目前对真核细胞的转化方法有多种,例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方 法:

        ①锂盐法;

        ②PEG法;

        ③原生质球法;

        ④电穿孔法。

        锂盐法和PEG法方法简便,但效率很低,每微克DNA只有几十个转化子或更低,一般不多用。

        原生质球法和电穿孔法转化率都较高,而且一般可得到高拷贝重组,其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时;电穿孔法简便、快速、高效,是理想的转化方法。选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。

        4、筛选

        转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA,用外 源基因两侧特异引物扩增筛选。然而,这只限于少量转化子转化子太多,则工作量太大。对于大量转化子的筛选.可用原位点杂交进行。

        即把相同量的不同转化子点在NC膜上,在原位对酵母细胞壁进行裂解,使之释放DNA。DNA经变性、中和后,可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法,在一张Nc膜上,可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子,而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时,转化子中外源基因拷贝数越多,则杂交后信号越强。

        5、鉴定表型

        筛选出的转化子需鉴定表型,以酵母为例,即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+

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        Eason老歌迷

        有帮助

        可以的,用真核表达蛋白一般有几个常用方法。一个是生化法(比如说,用磷酸钙介导的质粒dna转染真核细胞,用氯喹,用丁酸钠等)或者是,用物理办法(比如说电穿孔法等都行。效果都不错

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