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        制备高效率感受态

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        液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌E.COLI_DH5~E_JM109~EHB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50小时没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO , 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.
        TB溶液TRANSFORMATION_BUFFER~Kbr_~H~M~2~1~0PIPES_3.0G_10mM~Kbr_~H~M~2~1~0CaCl2.2H2O_2.2g_15mM~Kbr_~H~M~2~1~0KCl_18.6g_250mM~Kbr_~H~M~2~1~0add_water_up_to_950ml~Kbr_~H~M~2~1~0用 5N KOH 调PH至6.7-6.undefined低PH不溶
        在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g
        定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存.
        但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒 .
        【zihudie】
        (1)将置于液氮保存的大肠杆菌 划线在LB平板上,37℃培养活化。
        (2)挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基,18℃,200-250rpm培养。
        (3)当OD600=0.5-0.8时,用预冷的40mL离心管于4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。
        (4)用预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃,8000rpm离心10min,收集菌体。
        (5)重复第4步操作。
        (6)用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
        (7)冰浴10min后,分装保存于液氮中。
        本法效率极高,建议大家采纳
        【yog】
        1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
        2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
        3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
        建议用TSS法,简单方便,比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
        以下为转贴,具体方法请最好查阅文献。
        E.coli感受态细胞制备方法:
        单菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
        =0.2-0.4
        离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.
        转化: 加质粒(〈5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟,42oC 90秒,冰上2分钟,加LB至1ml
        , 37oC 1小时后铺抗生素平板。
        TSS:
        7.0ml pH6.1 LB
        2.0ml 50% PEG6000
        0.5ML dmso
        0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
        0.3ml ddH2O
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