制备高效率感受态的方法

摘要:

但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒.以下为转贴,具体方法请最好查阅文献E.coli感受态细胞 制备方法：单菌落平板至2ml LB, 37 oC 250 r/m ovn, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600=0....

液氮或低温冰箱中取出的 大肠杆菌 E.COLI_DH5~E_JM109~EHB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.挑直径1-3毫米的单菌落可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶 或80毫升/1升锥形瓶 的SOC培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.在18度 150-250RPM 培养19-50小时没有冷却摇床的可在室温,

但不可高于37度.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟再次离心回收菌体用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.在液氮或-80度保存.

TB溶液TRANSFORMATION_BUFFER___~K~Hp~M~Kp~MPIPES_3.0G_10mM___~K~Hp~M~Kp~MCaCl2.2H2O_2.2g_15mM__~K~Hp~M~Kp~MKCl_18.6g_250mM___~K~Hp~M~Kp~Madd_water_up_to_950ml___~K~Hp~M~Kp~M用 5N KOH 调PH至6.7-6.undefined低PH不溶

在加终浓度未55mM的MnCl2.4H2O 10.9g

定溶到1升, 过滤灭菌, 4度保存.

但有人提出, 冻存后转化效率降低, 且这种方法不适合大质粒.

【zihudie】

(1)将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上,37℃培养活化.

(2)挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基,18℃,200-250rpm培养.

(3)当OD600=0.5-0.8时,用预冷的40mL离心管于4℃,8000rpm离心10min,收集菌体.

(4)用预冷的TB Buffer重悬菌体,4℃,8000rpm离心10min,收集菌体.

(5)重复第4步操作.

(6)用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体,缓慢加入DMSO至终浓度7% .

(7)冰浴10min后,分装保存于液氮中.

本法效率极高,建议大家采纳

【yog】

1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)

2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min

3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min