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        质粒DNA的提取与纯化

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        一 实验目的
          1.掌握质粒 提取的原理及方法。
          2.掌握琼脂 糖凝胶电泳的方法。

        二 实验原理
          根据共价闭合环状的质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间在拓扑学上的差异发展起来的。在pH12-12.5时,线性DNA会完全变性,而共价闭合环状的DNA只是氢键断裂,酸中和后,共价闭合环状的DNA迅速准确地复性,而线性DNA聚合成网状结构,与变性的蛋白和RNA一道离心沉淀,上清液中的质粒DNA用乙醇沉淀出来。

        三 实验步骤
          已有许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3个步骤:
          1)细菌培养物的生长。
          2)细菌的收获和裂解。
          3)质粒DNA的纯化。
        质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法。
        1.碱裂解法:
          (1)在5m1含相应抗生素的LB培养基中接种一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。
          (2)将1.5m1培养物倒入Eppendorf管中,用微量离心机于4℃以12000rpm离心30秒。
          (3)吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。
          (4)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中,剧烈振荡。
          须使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散,将两个微量离心管的管底部互相接触,按图1所示方法同时进行振荡,可使沉淀迅速分散。
            
            溶液Ⅰ
            50mmol/L 葡萄糖
            25mmol/L Tris·CI(pH 8.0)
            10mmol/L EDTA(pH 8.0)。
            在101bf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟,贮存于4℃。
          (5)加200μl新配制的溶液Ⅱ.盖紧管口,快速颠 倒离心管,以混合内容物。将离心管放置于冰上。
          (6)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口,温和地振荡10秒钟使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3—5分钟。
          (7)4℃ 12000rpm离心10分钟,将上清转移到另一离心管中。
          (8)加等体积氯仿,振荡混匀, 4℃12000rpm离心10分种,将上清转移到另一离心管中。
          (9)用2倍体积的无水乙醇沉淀双链DNA。温和振荡混匀,于-18℃放置20分钟。
          (10)用微量离心机于4℃以12000rpm离心10分钟。
          (11)弃上清,加入70%冷乙醇洗沉淀1-2次
          (12) 真空干燥DNA沉淀后,将其溶于TE溶液中。

            溶液Ⅱ(现用现配)
            0.2mol/L NaOH
            1% SDS    溶液Ⅲ
           5mol/L乙酸钾 60ml
           冰乙酸 11.5ml
           水 28.5ml

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