LAK(Lymphokine activated killer cell)细胞的培养

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LAK(Lymphokine activated killer Cell )细胞是用细胞因子（如IL-2、IL-12 等）活化的杀伤细胞。即采用自体或同种异体外周血淋巴细胞，在体外经细胞因子活化3~5 天，增强其广谱抗肿瘤作用的功能，并使数量大幅扩增，成为LAK 细胞，可用于肿瘤的治疗。

基本原理
应用人重组IL-2（hr12 等）于体外活化和扩增外周血淋巴细胞，使其成为经细胞因子 活化的杀伤（LAK 细胞）。LAK 细胞呈现高度的MHC 限制的细胞毒作用。

试剂和材料
●新鲜的外周（肝素）抗凝血（或胎肝、胎脾等）.
●淋巴细胞分离液、CMF-Hanks 液.
●培养基
1、RPMI1640 培养基：(RPMI+10mmol/LHEPES+2mmol/L 谷氨酰胺+庆大霉素250μg/ml )
2、LAK 培养基：RPMI1640 培养液+10%人 AB 型血清+IL-2 1000μ/ml.
3、X-VIVO 15 培氧液.
●器皿与仪器。6 孔平底组织培养板75cm2 培养瓶、CO2 孵箱。

实验操作
1、外周血单个细胞(PBMC)的制备：取病人自体或O 型供血者肝素抗凝血40ml（病人或供血者，最好经3 天IL-2 的体内诱导后采血），加等量CMF-Hanks 液稀释，用淋巴细胞分离液剃度离心（）2000r/min 离心20min），从分离液界面吸取淋巴细胞，即PBMC 。
2、用CMF-Hanks 液或PBS PBMC2 次，用LAK 培氧基（RPMI1640 培氧液+10%AB 型血清+1000μ/ml IL-2）或用含有1000μ/ml IL-2 的X-VIVO 15 培氧液竟PBMC 细胞浓度调至2x106/ml，竟细胞悬液移至6 孔平板培养板内，置5%CO2 孵箱，37℃培养4 ~ 5 天。
3、将增殖后的细胞悬液以280Kg、离心5min，收集上清液，冻存于-20℃待用（用于TIL 细胞培养）。
4、用RPMI1640 培氧液或X-VIVO15 培氧液洗离心的细胞2 次。
5、经细胞计数，用输液用生理盐水重新悬浮细胞，调整细胞总数达5×108~ 1×109 回输给病
人。同时用形态学及功能分析等方法检测细胞活性，包括FACS 扫描分析、CTL 活性与NK活性，检测等。