荧光标记法检测细胞凋亡的操作步骤

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一、仪器与试剂

1. TdT酶(25U/μl);

2. 生物素标记的-dUTP(Biotin-dUTP)或地高辛标记的dUTP (Digoxingening-11-dUTP)1nmol/μl;

3. 反应缓冲液;

4. 洗涤缓冲液;

5. 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的亲合素或链霉亲合素 (2.5μg/ml)或抗地高辛抗体(1:30);

6. PI染液(含PI 5μg/ml及0.1%无DNA酶活性的RNA酶);

7. PBS 缓冲液;

8. 塑料盖玻片;

9. 贴壁生长的培养细胞;

10. 悬浮生长培养细胞的甩片或涂片;冰冻切片;常规石蜡切片。

二、操作步骤

1. 固定：培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃冰箱)后，用80%酒精再固定2h(-20℃冰箱);常规4%中性福尔马林固定、石蜡切片进行脱蜡、水合;

2. 洗涤：将玻片浸入PBS缓冲液，摇床上洗涤5min，三次;

3. 反应：洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞 或组织周围水分，按50μl/cm2 滴加反应液(每50μl反应液含TdT酶0.5μl ，标记的-dUTP 1μl)，使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上，盖上塑料盖玻片，置湿盒中，37℃孵育1h;

4. 终止反应：去掉塑料盖玻片，将玻片置于盛有洗涤缓冲液的染色缸内，洗涤2次，每次5min;

5. FITC标记：洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分，按50μl/cm2滴加FITC反应液(含FITC 2.5μg/ml)，室温下避光孵育10min;

6. 洗涤：将玻片置于洗涤缓冲液内，洗2次，每次5min;

7. PI复染：将玻片置于盛有PI染液的染色缸内，室温下避光染色30min

8. 封片：用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上，亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘，置暗盒中，尽早镜检观察;

三、结果判断

用荧光显微镜观察，选用蓝色激发光(波长488nm)，所有的细胞核 均被PI着色，显示出红色荧光，而凋亡细胞被特异地标记上FITC，显示出黄绿色荧光。