限制性内切酶的酶切实验原理与步骤

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【基本原理】

限制性内切酶 已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg 2+外，还需ATP等其他辅助因子的激活;切割位点和识别序列间的距离不同;有的内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II和III种类型。

II型限制性内切酶 只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。如 EcoRI和 HindIII的识别和切口分别为：

EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T

T TCGA↑ A C TTAA↑G

限制性内切酶 对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。

质粒DNA的相对分子量(Mr )一般在106～107 范围内，如质粒pBR322的相对分子质量 为 2.8×106 ，在细胞内有三种构型：①共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在;②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA;③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，完全开放成线状，简称线性DNA。如果要测定质粒DNA的相对分子量，最好把质粒用单一切口的酶水解得到线性DNA片段。三种构型的质粒DNA在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA>线状DNA >开环DNA。

本实验采用限制酶BamHI ，切割pUC18-KanR质粒中插入的分子 大小为1200 bp的KanR基因片段。

【器材】

1.水浴箱

2.高压灭菌锅

【试剂】

1.10×限制酶缓冲液

2.限制酶BamH I

3.DNA样品，重组质粒

【操作步骤】

1.在Ep管中分别加入以下试剂：

10×限制酶缓冲液 2μl

pUC18-KanR 2μl

ddH2O 15μl

BamH I 1μl

2.将上液混匀，37℃保温，1h。

3.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。

4.1% 琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。

pUC18/pUC19 cloning site图

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