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        DNA的限制性内切酶酶切

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        实验目的
        1. 学会DNA限制性内切酶 酶切技术。
        2. 琼脂 糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。

        实验原理
        质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列G↓GATCC,用BamHI酶切后形成线性质粒DNA。琼脂 糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段,小片段比大片段迁移快,凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小,必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是lDNA/Eco RI、lDNA/Hind III、lDNA/Eco RI+Hind III的酶切片段


        实验材料和试剂
        (一)实验材料
        实验二提取的质粒 pUC118
        (二)试剂
        1.限制性内切酶 BamHI
        2.l DNA/Hind III分子量标准
        3.双蒸馏无菌水
        4.溴酚蓝指示剂点样缓冲液
        5.1mg/ml溴化乙锭溶液
        6.电泳缓冲液(TAE)
        7.0.7% 琼脂糖凝胶(用TAE电泳缓冲液配制)

        (三)器材
        1.5ml Eppendorf管 200ml吸头
        (四)仪器
        微量移液器 离心机
        恒温水浴锅 电泳仪
        水平电泳槽 透射紫外观察仪

        实验步骤
        1. 取一个灭菌的Eppendorf管,依次加入下列试剂:
        双蒸馏无菌水 12ml
        10×Bam HI缓冲液 2ml
        质粒pUC118 5ml

        BamHI 1ml
        总体积 20ml
        2. 用手指轻弹管壁,使各种试剂混匀,快速离心,以集中溶液。
        3. 置37℃水浴60~120 分钟。
        4. 加入5ml溴酚蓝指示剂点样缓冲液,按实验三方法电泳,观察酶切反应结果,鉴定酶切效果。

        【提示】
        实验操作中注意的问题
        1. 酶切反应用的Eppendorf管和吸头,都要用新的,用双蒸馏水洗净,灭菌。使用前打开包装,用镊子夹取,不要直接用手去拿,以防手上的杂酶污染。
        2.DNA样品和限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
        3.要注意酶切加样的次序,一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂,最后才加酶。
        4.取酶时,吸头要从酶液的表面吸取,以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱中,防止酶失活。
        5.当样品在37℃保温时,要将Eppendorf管的盖子盖紧,防止因盖子未盖严密使水进入管内,造成实验失败。

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