不同细胞siRNA转染效率检测讨论

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【求助】不同细胞siRNA转染 效率，如何检测?

最近在做RNAi，用的siRNA ，然后Real-Time PCR，发现抑制率仅20-30%左右，与说明书说的70-90%相去甚远

咨询一些相关人员后，认为可能是转染 效率的问题，如果转染效率仅有20-30%，那抑制20-30%也就不少了。

因此想请教一下，一般不同细胞通常转染 效率是多少?

我用的是MT4(悬浮)、CEM(悬浮)、HepG2(贴壁)

听说悬浮细胞转染 效率要低，原代更低，贴壁好一些，是否如此?

另外就是siRNA的转染如何确定转染效率?

有人建议加上荧光，但是已经定了，好几千块钱，再定也不好;

或者阴性对照加上荧光，那样的话如何检测?

还有建议用个阳性对照，找个别人都做得很好的，抑制率很明确的基因来做个RNAi，再与自己的比较，那各位战友有什么建议没?

littleemma认为：

通常情况下悬浮细胞转染效率较低，贴壁细胞的转染效率因细胞不同，有些很高有些很低。HepG2的DNA转染效率大概有50%，siRNA暂时没做过。

如果你有GFP质粒和针对GFP的siRNA共转染，用只转染GFP质粒的孔做对照，可以看出转染效率。

如果没有针对GFP的siRNA就只能转染GFP质粒，一般情况下转染DNA好的话，转染siRNA也不会差的。个人觉得细胞本身的性质决定了转染效率。

littleemma认为：

如果HEK293或293T有你的目的基因的话，可以试一试在HEK293或293T中的干扰效率。因为HEK293或293T是认为转染效率较高的细胞。如果HEK293或293T效率好而你的细胞不好就是转染的问题;如果HEK293或293T干扰效果都不好，那你的siRNA可能设计的不太好。

lzc69：

请教littleemma，针对GFP的siRNA是不是在设计siRNA时就将GFP的表达序列设计进去?谢谢!!

littleemma：

不是的。针对GFP的siRNA和我们通常用的化学合成的siRNA一样，只不过是针对GFP基因的。