ELISA实验中的封闭液等常用试剂的配制

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ELISA实验中的封闭液小知识

ELISA的试剂盒说明上写封闭液用蔗糖溶液，一般是用BSA 或酪蛋白的蛋白分子封闭空白位点，蔗糖封闭的原理：

1、ELISA实验中，蔗糖本身没有封闭作用;

2、封闭液一般是BSA 、酪蛋白等或者是Tween等。

3、加蔗糖的主要目的是保护ELISA板子吸附(包被)的蛋白，起到“保护剂”的作用。

4、蔗糖溶液一般在ELISA板子经过BSA 封闭后加，当然也有将蔗糖加到封闭液中同时进行处理;那一种更好需要你实验后来验证。但多数选择前者。

封闭剂 还可用5%的脱脂乳(市售即可)，0.4%的明胶，但是实验表明前者比较好，后者不容易洗干净未结合上的明胶。

封闭剂的原理就是与酶联板上未结合抗原 或抗体的微孔中用封闭剂封闭上，结合抗体或抗原的时候就不会产生非特异结合了，不会影响实验的准确度。

tween的作用：虽然不能单独封闭，但和BSA在封闭时会起到清洗非特异性结合或结合不牢固的蛋白的作用，假如抗体包被在板上会出现YY-

附件：ELISA实验中缓冲溶液等试剂的配置

ELISA实验中是以抗原和抗体的免疫反应为基础，ELISA试剂以及各种溶液如何配置?最近刚做了下ELISA实验，把各种ELISA配置方法汇总如下：(1)　ELISA实验包被缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(3)　ELISA实验稀释液;(4)ELISA实验终止液(5)ELISA底物缓冲液(6)ELISA实验TMB(四甲基联苯胺)使用液(7)　ELISA实验ABTS使用液(8)ELISC。

试剂

(1)　ELISA实验包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):

NaHCO3 1.59克

NaHCO3　 2.93克

加蒸馏水至1000ml

(2)　ELISA实验洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 　　　　 　0.2克

Na2HPO4·12H2O　　2.9克

NaCl　　　　　 　　8.0克

KCl　　　　　　　 　0.2克

Tween-20　0.05%　 0.5ml

加蒸馏水至1000ml

(3)　ELISA实验稀释液：

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

(4)　ELISA实验终止液(2M　H2SO4)：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

(5)　ELISA底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml

0.1M 柠檬酸(19.2克/L)　　　　　 24.3ml

加蒸馏水50ml。

(6)　ELISA实验TMB(四甲基联苯胺)使用液:

TMB(10mg/5ml无水乙醇) 0.5ml

底物缓冲液(PH5.5)　　　 10ml

0.75%H2O2 32μl

(7)　ELISA实验ABTS使用液:

ABTS　　　　　　　　0.5mg

底物缓冲液(PH5.5)　 1ml

3%H2O2 2μl

(8)ELISA实验封闭液：

牛血清白蛋白(BSA) 5克

加洗涤缓冲液至100ml。

值得一提的是有的封闭液中含有脱脂奶粉，不适合长期保存。

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为了保证ELISA实验的准确性，实验操作中加入的缓冲液和各组分一定要精确，将洗涤液加入酶标板中的时候防止加入的试剂混入另外一个酶标孔，严防交叉污染。