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        PCR及RT

        互联网

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        1. 问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂 糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
        可能原因:
        1)RNA被降解
        建议解决方法:
        在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;
        在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;
        如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
        2)RNA中包含逆转录 抑制剂
        建议解决方法:
        通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
        逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA ,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。
        将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
        3)多糖同RNA共沉淀
        建议解决方法:
        使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
        4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
        建议解决方法:
        确定退火温度 适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
        对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.
        确定GSP是反义序列。
        5)起始RNA量不够
        建议解决方法:
        增加RNA量。
        对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA
        6)RNA模板二级结构太多
        建议解决方法:
        将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
        提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
        注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
        注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。
        如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
        7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
        建议解决方法:
        在PCR前用RNaseH处理。
        8)靶序列在分析的组织中不表达
        建议解决方法:
        尝试其他靶序列或组织
        9)PCR没有起作用
        建议解决方法:
        对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

        2.问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
        可能原因:
        1)PCR引物设计较差
        建议解决方法:
        避免在引物3"端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
        2)DNA含有抑制剂
        建议解决方法:
        诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。
        3)富含GC的模板
        建议解决方法:
        对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。
        4)模板浓度太低
        建议解决方法:
        使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
        5)镁离子浓度太低
        建议解决方法:
        从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
        6=退火温度太高
        建议解决方法:
        使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。

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