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        溶菌酶的测定

        互联网

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        溶菌酶( lysozyme )主要是由吞噬细胞合成并分泌的一种小分子粘性蛋白,属乙酰多糖酶。存在于唾液、乳汁、泪液和鼻及气管等分泌物中,能溶解革兰氏阳性细菌。由于它的高等电点( pH11.0 ),使它能与细菌牢固结合,并水解细菌细胞壁肽聚糖,使细菌裂解死亡。

        本实验在平板上进行唾液酶的测定。溶菌酶与枯草芽胞杆菌( Bacillus subtilis )作用后,可使该菌因细胞壁破坏而溶解,致使琼脂板加样孔周围出现溶菌环。溶菌环直径与样品中溶菌酶含量的对数呈直线关系。

        【材料】

        1• 无菌 PBS ( pH6.4 , 1/15mol/L ), 5mol/LKOH , 3%PBS 琼脂,溶菌酶标准品,受验者唾液。

        2• 枯草芽胞杆菌 12 小时培养物。

        3• 10×100 试管,试管架,无菌平皿,打孔器,微量加样器。

        4• 分光光度计,水浴箱,温箱等。

         【方法】 免疫学实验技术论坛   http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html

        1. 菌液配制:将 PBS 加入枯草芽胞杆菌斜面,置室温 5-10 分钟后制成菌悬液;在波长 640nm 处,测定菌悬液的浓度,并将菌液浓度调至透光率 30-40% 。

        2. 溶菌酶标准液配制:称取溶菌酶标准品,用 PBS 配成 1000 m g/ml ,置冰箱冻存,临用时再稀释成 100 、 50 、 25 和 10 m g/ml 。

        3. 收集唾液标本:待检测者用清水漱口后,将唾液收集于消毒平皿内待用。

         4. 加热融化 3% 琼脂 ,冷至 60 -70℃ ,与预热好的枯草芽胞杆菌菌悬液等体积混合,到平板。用打孔器在平板上打孔,孔间距约 1.5cm , 每平板可打孔 8-9 个。

        5. 各孔内依次加溶菌酶标准品和唾液样品,每孔 20 m l 。

        6. 置于 24 -26 ℃ 12-18 小时后测量溶菌环直径。

        【结果判断】

        记录溶菌环的直径( mm )于下表,绘制标准曲线,并从标准曲线上查出所测样品的溶菌酶含量。

        【作业】

        1• 记录标准溶菌酶样品的溶菌环直径,绘制标准曲线。

        2• 记录和报告唾液样品的溶菌酶含量。

        图 2-1 唾液样品中的溶菌酶作用与枯草芽孢杆菌产生的溶菌环。上排为溶菌酶标准液作用

        后产生的溶菌环,下排为唾液样品中的溶菌酶作用后产生的溶菌环。

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