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        免疫荧光技术

        互联网

        2033

        基本原理
          将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
        试剂与 仪器
        磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
        荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释
        缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
        搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
        有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
        荧光显微镜
        玻片架
        滤纸
        37℃温箱等。
        实验步骤
        1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。
        2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。
        3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。
        4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
        5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
        (-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。
        注意事项
        1. 对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。
        2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

         

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