紫外分光光度法测定核酸的含量

一、目的
1、了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。
二、原理
核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健 系统（－C＝C 一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。核 酸（DNA，RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律， 可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH 溶液中嘌呤、 嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们 的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH 溶 液中进行。
核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含 有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸 收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液 的pH 和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH = 7.0）如下：
DNA 的ε（ρ）= 6 000 － 8 000
RNA 的ε（ρ）= 7 000 －10 000
含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022~0.024。采用紫外分光光度法测 定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，浓度为1μg/mL 的DNA 溶液 其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024。因此， 测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中 核酸的含量。
该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg／mL 的含量即可测出。对于 含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若 样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。
三、器材
1、分析天平；2、离心机； 3、容量瓶；4、紫外分光光度计；5、吸管
6、冰浴或冰箱
四、 试剂
1、5%~6%氨水
2、钼酸铵-高氯酸 试剂 （沉淀剂）。如配制200mL 可在193mL 蒸馏水中加
入7mL70%高氯酸和0.5g 钼酸铵。
五、操作
1、用分析天平准确称取待测的核酸样品500 mg，加少量蒸馏水调成 糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%~6%氨水调至pH7，定容到50mL。
2、取2 支 离心管 ，向第一支管内加入2mL 样品溶液和2mL 蒸馏 水； 向第二支管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。 混匀。在冰浴或冰箱中放置30 分钟后离心（3000r/min，10 分钟）。从第一 管和第二管中分别吸取0.5mL 上清液，用 蒸馏 水定容到50mL。用光程为1cm 的石英比色杯，于260nm 波长处测其光吸收值（A1 和A2）。
六、计算
如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸， 即可将样品配制成一定浓度的溶液（20~50kg/mL）在紫外 分光光度计 上直接 测定。