紫外吸收法测定核酸的含量

一、目的

学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、原理

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子强度发生变化。它们的经典数值（pH = 7.0）如下：

DNA 的ε（ρ）= 6 000 - 8 000

RNA 的ε（ρ）= 7 000 - 10 000

小牛胸腺DNA 钠盐溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 6 600，DNA 的含磷量为9.2%，含1μg/mL DNA 钠盐的溶液光密度为0.020。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定：在260nm 波长下，浓度为1μg/mL 的DNA 溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL 的RNA 溶液其光密度为0.024。

因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD₂₆₀nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40%，这就是众所周知的增色效应（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应（hypochromic effect）。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1.试材：核酸样品DNA 或RNA。

2. 主要仪器

（1）分析天平

（2）紫外分光光度计

（3）冰浴或冰箱

（4）离心机

（5）离心管（10mL）

（6）烧杯（10mL）

（7）容量瓶（50mL、100mL）

（8）移液管（0.5ml、2mL 和5mL）

（9）药品勺和玻璃棒

（10）试管和试管架。

3.试剂

（1）5%~6%氨水：用25%~30%氨水稀释5 倍。

（2）钼酸铵-过氯酸试剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g 钼酸铵溶于96.4mL 蒸馏水中。

四、操作步骤

1.核酸样品纯度的测定

（1）准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量的水，用5%-6%氨水调至pH7,定容至50mL.

（2）取两支离心管，甲管内加入2mL 样品溶液和2mL 蒸馏水；乙管内加入2mL 样品溶液和2mL 沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min 离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL 上清液，用蒸馏水定容至50mL.选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度。

（3）计算

如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液（20-50μg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。

2.核酸溶液含量的测定

当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm 处光密度作为对照。

（1）取2 支离心管，每管各加入2mL 待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL 蒸馏水，向乙管内加2mL 沉淀剂。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3 000r/min 离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1-1.0 之间。选用光程为1cm 的石英比色杯，在260nm 波长下测其光密度OD260nm。

（2）计算