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        siRNA制备方法(how to get siRNA)

        互联网

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        In vitro
        A. . 化学合成法
        B、体外转录
        C、酶切长链dsRNA
        In vivo
        D、载体表达siRNA
        E、PCR合成siRNA表达元件

        A. 化学合成法
        1.方法简单、快速,需要时间短;获得的siRNA纯度高
        2.适用于短期体外实验研究,尤其适用于需要单一siRNA序列的研究
        3.siRNA可进行标记
        4.需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列
        5.不适用于长期研究
        6.不适用于siRNA序列的筛选

        siRNA序列设计注意事项
        1.选择以AA开头的19-21nt长的序列
        2.靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始,到终止密码子上游75-100nt处结束
        3.选择 2-4个靶定序列,以筛选特异性最好的进行实验
        4.选择的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。
        5.若需要发卡结构,发卡部分长度一般为6-9nt,有文献报道9nt效果较好.
        6.最后,选择的DNA 片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性
        7.设定适当的对照

        设置适当的siRNA对照
        1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成,但排列完全不同,且不与其它基因由同源性
        AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6)
        ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)
        2)1-2碱基错配的 siRNA对照 (1-2nt)
        AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG
        AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A错配

        siRNA序列设计
        根据文献报道,使用确定的siRNA序列
        许多网站提供siRNA设计软件,只需输入靶定基因序列,即可提供候选siRNA序列;比如Ambion公司,武汉晶赛

        B、体外转录合成短的siRNA
        1.T7 RNA 聚和酶体外转录DNA,直接产生小片断的siRNA,
        2.快速、灵活,适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时
        3.siRNA可进行标记
        4.可重复性差,不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究
        ( 使用 T7 RNA 聚合酶需要转录的RNA前两个核苷酸为GG or GA 以保证高的合成效率 (Milligan 1987). 在siRNA的5‘ 需要是GG or GA 序列,同时在3’端又需要有两个UU ;这就极大的减少了可能的siRNA的靶位点 这些限制了体外转录作为产生siRNAs稳定的方式)

        (体外合成一段目的基因的寡核苷酸(有义链和反义链),其3‘端含有8个碱基与T7启动子序列互补;将T7启动子与模板混合,Klenow酶补平,使用T7RNA酶进行转录。杂交,消化、纯化 )

         

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