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        Northern blot protocol

        互联网

        2066

        1.Total RNA isolation:
        测定OD 260 ,OD 280 及两者比值,换算出RNA的浓度。并电泳鉴定。
        2.Gel:
        以80ml的1.5%甲醛琼脂糖凝胶为例:
        agrose:1.2g
        dd H 2 O:57.6ml
        10×RNundefined(RNA buffer):8ml(RNB具体配方见后,用表示,下同)
        甲醛溶液:14.4ml
        3. Electrophoresis:
        (1)加样:(以取20μg RNA为例)在0.5ml管中加20 μg RNA+2-4倍RNA体积的SB溶液_,votex,65℃热变性10min,立即上冰5min,微离心一下,加相应的10×loading buffer(大连宝 生物 公司taq酶系列会提供),混匀,准备上样。
        (2)预电泳:在正式上样电泳前,在胶点样孔中各加一点10×loading buffer(加的孔数要超过正式电泳所用的点样孔)先看点样孔漏不漏,预电泳15-20min。此工作可在RNA变性时进行。这一方面可判断胶漏不漏,另一方面可使胶活化。
        (3)正式电泳:将(1)步的混匀样全部加入点样孔,50V电泳4-5小时(电泳时间长短还要依你胶的大小而定,一般要使loading buffer跑到四分之三左右。
        电泳最好在4℃冰箱里进行,并且要有循环器在电泳缓冲液两边进行交换,以防两端缓冲液PH相差过大。电泳缓冲液用1×RNB。
        4.转膜:
        (1)在转移槽内放好玻璃板,铺好滤纸桥,紧贴玻板。
        (2)倒入转移液(20×SSundefined),浸透滤纸桥,驱除气泡,同时按胶大小剪好合适的膜(膜为Amersham公司的Hybond-N+膜)和两张同样大小的滤纸。
        (3)将胶从加样孔先接触滤桥面,自一端将胶滑放至滤纸桥上,注意不留气泡。
        (4)将膜放在胶上,小心慢速,自一端起紧贴胶面,检查及排除气泡,用一干净玻棒轻缓的在膜上滚几下以排除气泡。
        (5)用保鲜膜在四周封边,在尼龙膜上放上两张滤纸片,再堆上5-8cm吸水纸堆,压上重物,10-24hr。
        (6)转膜完毕,移去吸水纸,将膜取出,紫外交联(245nm1.5J/cm2照射膜1min45s)并标好膜的正面及加样顺序,将膜在6×SSC或2×SSC溶液中浸泡一下,纯水冲洗一下。
        (7)用亚甲基蓝溶液浸泡摇晃染色3-5min,纯水摇床脱色,可见RNA电泳条带,标好28S,18S。
        5.探针的标记:(下列物质除α- 32 P dATP购自Amersham公司,其余来自于Promega公司的labeling kit)
        (1) 取25-40ng的模板DNA(假设以1μL为例)于0.5ml管中,加11μL dd H 2 O,100℃变性5-10min,立即上冰5min。
        (2) 在冰上依次在管中加入:
        BSA: 1μL
        dNTP(-dATP):1μL
        labeling 5×buffer: 5μL
        klenow酶:1μL(5U/μL)
        α- 32 P dATP(最后加) 5μL
        (合计:25μL体系)
        振荡后放入铅盒,37℃ 1hr,加200μL dd H 2 O终止反应。可4℃短暂保存。
        6.探针的纯化(sephades G-50柱层析法):
        (1)1ml注射器底部用无菌玻璃棉填塞,加剪盖的0.5ml管放入体积较大的 离心管 中,注射器中装填用STE平衡的sephades G-50凝胶。
        (2)层析柱室温离心,1000g×2min,再重复步骤(1)(2),使注射器装满sephades G-50凝胶。
        (3)将标记好的探针滴加在层析柱上,离心,1000g×4min,收集0.5ml管中液体,即为纯化好的标记cDNA探针。

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