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        动物组织RNA提取及纯化

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        2870
        实验概要
        提取样品组织中的RNA并消除DNA污染
        实验原理
        Trizol裂解细胞使RNA释放
        beta巯基乙醇一直RNase活性
        酚-氯仿抽提分离RNA
        RNase-Free DNase消除DNA污染
        主要 试剂
        Trizol
        无水乙醇
        氯仿(三氯甲烷)
        异丙醇
        RQ1 RNase-Free DNase(Promega,M6101)
        液氮
        RNase-Free water
        醋酸钠缓冲溶液(3M,pH5.2)
        主要设备
        离心机
        研钵
        热块
        离心机
        实验材料
        组织样品
        实验步骤
        组织中total RNA的提取
        取适量组织(约30mg)于研钵中加入液氮研磨,研碎后转移至EP管中;
        向样品中加入1mL Trizol,吹匀,放置5min;
        向上述EP管中加入200μL氯仿,剧烈震荡15s,室温放置3min,4℃12000rpm离心15min;
        取上层水相500μL于新的EP管中(注意不要吸入沉淀),加入100μL氯仿,剧烈震荡15s,室温放置3min,4℃12000rpm离心15min;
        取上层水相400μL于新的EP管中(注意不要吸入沉淀),加入400μL异丙醇,室温放置10min,4℃12000rpm离心10min;
        弃上清,加入1mL 75%乙醇洗涤,轻弹混匀,4℃7500rpm离心5min;
        20μL RNase-Free Water溶解RNA;
        紫外测定RNA浓度,记录A260/280,, 琼脂 糖电泳鉴定RNA质量。
        Total RNA中DNA的

        DNA消化体系(100μL)
        RNA样品:10mg(量不足可适量减少)
        RQ1 DNase 1undefined Reaction Buffer:10μL
        补水至100μL
        如体系加好样品,37℃孵育30min;
        向体系中加入100μl DEPC水;
        加入100μl氯仿,震荡混匀,室温放置10min;
        4℃13200rpm离心15min,吸取上层清夜150μl转移至新的EP管中;
        加入0.1倍体积(15μl)NaAc Buffer及等体积(150μl)异丙醇,室温沉降30min;
        4℃13200rpm离心15min,弃上清,75%乙醇洗涤沉淀;
        4℃12000rpm离心5min,弃上清,开盖放置晾干乙醇;
        20μl RNase-Free水溶解RNA;
        紫外测量浓度及A260/280,1.5% 琼脂 糖电泳检测RNA状态。
        注意事项
        所用工具均经高温灭菌
        EP管、枪头经DEPC处理
        实验地点尽量选择空气流动较少,实验时带口罩等。
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