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        鼠脑RNA提取、RT-PCR及GST融合蛋白纯化

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        3471

        鼠脑RNA提取、RT-PCR及GST融合蛋白纯化

        一.鼠脑RNA提取
        (1)RNA提取常用3种方法:A.异硫氰酸胍、氯化铯密度梯度分离植物RNA
        B.SDS-酚-氯仿法
        C.硫氰酸胍-酚-氯仿法在制备用于反转录PCR的RNA时最实用

        (2)总RNA的提取方法是基于RNA与其他胞内大分子在溶解性和沉降性上的差异得以实现的,提取基本步骤:
        1.破碎细胞
        2.RNase失活
        3.RNA去蛋白
        4.RNA与其他大分子的物理分离:酚、离子变性剂和胍盐组合抽提(酚、氯仿抽提步骤,将RNA从DNA中分离出来,在操作过程中的酸性条件下,DNA溶解性降低,大部分留在有机相,RNA则进入水相)
        5.将RNA抽提到水相后,用盐将之在乙醇或异戊醇中沉淀下来。

        (3)RNA极易降解,要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性RNA酶对RNA的降解。
        1.外源RNase污染可通过预先采取措施避免。
        ①实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有RNA酶污染,用0.1%DEPC的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,小指管、PCR管和其他用品。浸泡12h后,121℃高压灭菌30min(2次),70℃—80℃烘干。
        ②取鼠脑的剪刀、研钵、镊子等干热灭菌:160℃,2小时。
        2.内源RNase在一些组织中,如胰腺中相当丰富,内源RNase活性可通过使用足量的胍盐、酚、SDS或其他的强变性剂得以大大降低。
        3.如果发生了不可解释的降解,就应该考虑加入RNase抑制剂。

        (4)TaKaRa RNA提取试剂盒提取RNA(稍做改动)
        Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。Trizol适用于从多种组织和细胞中快速分离总RNA。
        1.用液氮速冻,将组织磨成粉末,趁液氮尚未挥发光时,把粉末转移到eppendorf 管中,每50—100mg组织加1.0ml的 Trizol。(匀浆的样品可在-60—-70℃保存至少一个月)
        2. 匀浆后的样品15—30℃温育5分钟(使核蛋白复合体彻底解离),加入200µ l氯仿,用手剧烈振荡混匀15秒,冰浴2—3分钟。
        3. 用台式离心机,不超过11400转/分,2—8℃离心15分钟。混合物分3层:下层红色酚氯仿相,中间层和上层无色水相。RNA在水相中,水相体积约为Trizol体积的60%,即0.6ml。
        4. 将水相小心转移到RNase-free 1.5ml离心管里,加入0.5ml的异丙醇(沉淀RNA),-20℃静置20分钟。(不要吸取任何中间层物质,否则会出现Genomic DNA污染。)
        5. 用台式离心机,不超过11400转/分,2—8℃离心10分钟。此时在管底和管壁可见沉淀的RNA,为凝胶状小球。
        6. 小心移去上清液,防止沉淀丢失。
        7. 用75%酒精洗涤1次,至少1ml,涡旋振荡混匀,不超过8900转/分,2—8℃离心5分钟。
        8. 尽可能彻底地吸走上清,防止丢失RNA沉淀。
        9. 空气干燥或真空干燥5-10分钟(不可真空离心干燥)。
        10.50μl DEPC-H2O溶解。用枪吹打几次使RNA溶解,存于-20℃。

        二.RT-PCR
        (1)逆转录(20μl),依次加入:
        1.MgCl2(25mM) 4μl
        2.无Rnase H2O 1.5μl
        3.10×RNA PCR buffer 2μl
        4.40单位/μl胎盘抑制剂 0.5μl
        5.dNTP 混合液(各10mM) 2μl
        6.特异性引物(终浓度2pM) 4μl
        7.样品RNA 5μl
        8.AMV反转录酶 1μl
        温育在42℃反应60min
        反应管99℃加热5min,使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。

        (2)PCR(50μl体系):(逆转录20μl体系每管分装2管10μl+以下40μl组成50μl PCR体系)
        1.无Rnase水 23.5μl
        2.10×RNA PCR buffer 4μl
        3.MgCl2(25mM) 3μl
        4.上游引物(终浓度0.8pM) 4μl
        5.下游引物 4μl
        6.TaKaRa Taq 1.5μl
        94℃ 预变性3 min
        40个循环 94℃30s 两个温度50℃/55℃30s 72℃45s

        72℃10min 取扩增样20μl,用1.2%琼脂糖凝胶电泳来分析扩增结果。不用甲醛变性胶,普通琼脂糖凝胶即可。

        用特异性5’和3’引物PCR失败,改用oligodT代替特异性3’引物后得到的片断小于目的片断,分析认为是RNA二级结构严重,尝试65℃保温消除二级结构的方法进行RT-PCR,即将特异性引物和总RNA混合后先65℃保温10分钟,再加入dNTP等其他成分,结果表明该法可行。

        三.GST融合蛋白纯化
        (1)GST亲和纯化
        1.介质保存:20%乙醇
        2.所需试剂:
        ①10×PBS(1L): pH7.4 (4℃)
        150mM NaCl(87.75g),16mMNa2HPO4(57.3g),4mM NaH2PO4(6.24g)
        ②10×洗脱前buffer(100ml): pH8.0 (25℃)
        50mM Tris(6.1g),100mM NaCl(5.8g)
        ③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml): pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.0
        50mM Tris(3.035g),100mM NaCl(2.925g)
        洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM,加还原型谷胱甘肽(干粉)至终浓度20mM
        也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM,未对比过。
        8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer(加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽)
        ④3M NaCl

        3.纯化步骤及注意事项:
        ①PBS平衡柱子:至少5个柱体积
        ②上样:经对比发现,上样流速需极慢才能结合,一般上样过夜(纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力)
        ③PBS洗杂蛋白:洗到紫外监测基线平,至少1小时,时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时,这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。
        ④洗脱前buffer换体系:至少2个柱体积,8ml介质一般用20ml
        ⑤洗脱buffer洗脱蛋白:洗脱速度很快,一般第2、3管浓度最大,注意收峰
        ⑥3M NaCl再生柱子:一般会洗出一个小盐峰,再生时间不可过长,否则对柱子有伤害,5个柱体积即可

        (2)凝血酶酶切融合蛋白(以NGB为例)
        先后使用过sigma和鼎国的凝血酶,sigma的酶效率更高。
        鼎国凝血酶买来为干粉,3000U每管,溶于1ml凝血酶酶切buffer(补1M CaCl2至终浓度2.5mM),分装至每管10μl共100管,30U/管。
        合并GST柱下来的目的蛋白,紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。用鼎国凝血酶摸酶浓度:每35mg蛋白用凝血酶50μl,酶切约20小时。
        对比25℃水浴酶切和摇床中酶切,定时取样检测酶切结果,发现摇床中酶切更快(可能是摇动过程中酶与蛋白能充分结合),但摇床中酶切产生的沉淀也更多。
        四.我负责配制的几种试剂
        (1)蛋白marker:
        鼎国marker:直接分装,5μl/管
        华美marker:每瓶干粉加300μl水和100μl 4×loading buffer,充分溶解混匀后分装于40管500μl小指管,10μl/管,沸水中煮3-5分钟。(小指管一定要盖严,否则煮时进水)
        (2)IPTG:(500mM)分子量238.31
        在超净台中操作, 一般一次配5g,将干粉溶于42ml milliQ水,经一次性滤器滤过后,
        分装至灭菌小指管中。(IPTG一定要充分溶解)
        (3)氨苄:(50mg/ml)
        在超净台中操作, 一般一次配5g,将干粉溶于100ml milliQ水,经一次性滤器滤过后,
        分装至灭菌小指管中。

         

        (责任编辑:大汉昆仑王)
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