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        mRNA差异显示法

        相关实验:差示反转录 PCR 实验

        最新修订时间:

        原理

        几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端,都带有一个多聚的腺苷酸结构,即通常所说的poly(A)尾巴。因此,在RNA聚合酶的作用下,可按mRNA为模板,以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到,在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基,除了为A的情况之外,只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征,P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物,它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成,用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示,这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是,采用这三种引物,可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增,因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的,可以在测序胶上明显分辨开来,从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。

        材料与仪器

        步骤

        一、实验材料
         
        1.  红豆杉细胞
         
        未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。
         
        2.  寡核苷酸引物
         
        (1)3’锚定引物:
        ①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’
        ②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’
        ③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
         
        (2)5’ 随机引物:
         
        Kit引物:
        ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’
        ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’
        ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’
        ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’
        ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’
        ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’
        ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’
        ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’
         
        生工引物:
        ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’
        ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’
        ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’
        ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’
        ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’
        ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’
        ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’
        ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’
         
        特异引物:
        ①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’
        ②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’
        ③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’
        ④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’
        ⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’
        ⑥3ben:5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’
        ⑦Phen:5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’
         
        二、 实验方法
         
        2.  总RNA的提取与检测
         
        (1)用品的准备
         
        塑料器皿,如离心管、Tip头等用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌并烘干后使用;所用溶液用0.1%的DEPC水37℃浸泡12小时以上,高压灭菌后4℃保存;玻璃器皿经180℃烘烤12小时以上,冷却备用。
         
        (2)试剂的配置
         
        ① CSB缓冲液
         
        42 mmol/L 柠檬酸钠(Sodum citrate)
         
        0.83%(W/V)十二烷基肌氨酸钠(N-lauryl sarcosine)
         
        0.2 mmol/L 巯基乙醇(β-mercaptoethanol)(使用前加入)
         
        (3)RNA提取
         
        对悬浮培养细胞A、B进行RNA提取,提取步骤如下:
         
        ① 50 ml 离心管中加入10 ml 变性匀浆液,冰浴5分钟。
         
        ② 取0.5 g 细胞在液氮中研磨至粉末,转移至预冷的变性匀浆液中,加200 ul β-巯基乙醇,振荡混匀。
         
        ③迅速加入1 ml 2 mol/L 乙酸钠(pH4.0),充分混合。
         
        ④  加入10 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。
         
        ⑤ 加入2 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。
         
        ⑥ 4℃,12 000 g,离心20分钟。
         
        ⑦ 小心移取上层水相,弃去中间相和下层有机相。
         
        ⑧ 加入6 ml 水饱和酚,剧烈振荡10~15秒,在冰上放置5分钟。
         
        ⑨ 加入6 ml 氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡10~15秒,在冰上放置15分钟。
         

        来源:丁香实验

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