免疫组织化学技术疑难问题剖析
1．非特异性背景染色
非特异性背景染色的常见问题和解决办法
常见问题 解决办法
操作过程中漂洗不充分 每步步骤后冲洗3次，每次5分钟
加试剂后切片干燥 防止切片干燥
组织切片折叠 勿取折叠处观察染色结果
组织中所含过氧化物酶未阻断 可再配制新鲜3％H20：封闭，孵育时间延长
组织中所含内源性生物素未封闭 使用阻断剂阻断内源性生物素
组织抗原
弥散 组织及时固定，固定液要符合标准
切片黏附剂过厚 重新配制黏附剂涂片
血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间或再次用2％BSA封闭
2．染色过强。
染色过强的常见问题和解决办法
常见问题 解决办法
一抗浓度过高或抗体孵育时间过长 降低一抗浓度或缩短一抗孵育时间
孵育温度过高，超过37℃ 一般室温20～28℃
生物素化二抗或SABC-POD孵育时间过长 缩短孵育时间
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5―10分钟，以显微镜下观察为准
3．染色弱。
染色弱的常见问题和怒决办法
常见问题 解决办法
抗体
浓度过低或孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期 及时更换试剂
操作中。滴加试剂时缓冲液未沥干。致使试剂稀释 每步骤滴加试剂前吸干切片中多余的缓冲液
复染或衬染太深 复染时要淡染细胞核
室温太低，低于15℃ 适当延长孵育时间
组织经固定和包埋等处理后组织抗原被破坏， 新鲜组织及时固定。防止自溶
残留抗原未被抗体检出
蛋白过度封闭 封闭时间不要超过10分钟
4．染色阴性。
染色阴性的常见问题和解决办法
常见问题 解决办法
操作步骤错误 重新实验，设立阳性对照
组织中无抗原 设立阳性对照实验，以验证实验结果
一抗与二抗种属关系错误 仔细检查一抗与二抗种属关系
试剂盒与显色系统不相匹配 使用与试剂盒相匹配的显色系统
试剂盒中一种或多种试剂活性降低 不同批号试剂盒不能混用，不能使用过期试剂盒
