胞外转录反应 （in vitro transcription）

由于RNA聚合酶一般由数个次单元组合而成，早先要在试管内应用RNA聚合酶的转录活性合成RNA并非易事，但这个问题在SP6, T3 及T7 等噬菌体的RNA聚合酶陆续被发现以后，情况已完全改观。这主要是因为这类RNA聚合酶由一条多胜肽 （polypeptides） 所构成，其在进行转录反应时所须辨认的启动子长度仅20bp左右，而且转录起始位置非常明确，转录效能良好，成了目前进行胞外转录反应时的最佳选择。要进行胞外转录反应时，仅需将目标基因次选殖 （subclone）至带有SP6, T3 或T7 启动子的转录载体，或者运用PCR技术在基因的一端加上SP6, T3 或T7 启动子的序列，即可运用对应的RNA聚合酶活性在试管内合成正意股或反意股RNA. 以质体DNA为模版进行胞外转录反应前，应先用限制酶自目标基因的一端切开，以免转录反应持续进行至载体的序列 （run-on），但在选择限制酶切位时应避免使用目标基因也带有的切位；限制酶内切好的质体DNA经phenol/chloroform萃取的后，即可用来进行胞外转录反应。

仪器用具：微量离心机

药品试剂：    Plasmid DNA 酵解产物pBlueGus/HindIII 及pBlueGus/BamHI;5×Transcription buffer （200 mM Tris-Cl, pH 8.0; 40 mM MgCl₂; 10 mM;spermidine-（HCl）3; 125 mM NaCl; Roche）NTPs （含ATP, CTP, GTP 及UTP 各2.5 mM）；RNase 抑制剂RNasin （40 U/μL）；T7 与T3 RNA polymerase （Roche） ;dH2O/DEPC;100 mM DTT （dithiothreitol）；DNase （RNase-free）

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1）， 以下简称PCI;Chloroform/isoamyl alcohol （24:1）， 以下简称CI

方法步骤：

1） 取4 支1.5 mL 微量离心管，分别标示 #1, #2, #3 与 #4,再依下表依序在#1 与 #2 加入胞外转录反应所需各项试剂 （单位 μL）：

注意： 在逐一加入各项反应试剂时，微量离心管维持于室温即可，以免在低温时，DNA 遇到转录缓冲液所含spermidine 产生沉淀。进行下列实验时，请务必戴手套！

2） 以手指头轻弹离心管壁使混合均匀，离心数秒后放置于37℃恒温水槽作用1 h.

3） 反应结束时，自 #1 与 #2 分别取出4 μL反应物，放到微量离心管 #3 与 #4中，将 #3 与 #4 存放于 -20℃冷冻柜中。

4） 取1 μL DNase 加到 #1 与 #2,混合均匀后放置于37℃作用15 min,以便去除DNA 模版。

5） 反应结束后，加入53 μL dH₂O/DEPC,以100 μL PCI萃取一次，剧烈震荡后，离心14,000 rpm 5 min.

6） 以微量移液器P200 将上层液移至一新的微量离心管，下层的PCI以100 μLdH2O/DEPC反萃取 （back-extraction） 一次。

7） 以微量移液器P200 将上层液移至步骤6） 的新离心管。

8） 估计两次上层液聚集的后的总体积，并以等体积的CI 萃取一次，剧烈震荡后，离心14,000 rpm 5 min.

9） 以微量移液器P200 将上层液移至一支新的微量离心管，加入0.1 倍体积的3 M NaOAc （pH 5.2） 及2.5 倍体积的绝对酒精。

10） 混合均匀，并置于 -20℃过夜，以便沉淀RNA.

隔天：

1） 自冷冻柜取出微量离心管，以14,000 rpm 于4℃离心10 min.

2） 仔细移去上清液的后，加入0.5 mL 70%酒精。

3） 以14,000 rpm 于4℃离心5 min。

4） 去除上清液的后，将微量离心管倒置于一张干净的卫生纸上大约30 min,以便风干RNA。

5） 以10 μL dH₂O/DEPC溶解RNA沉淀。