• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        大片段DNA测序(>50KB)

        互联网

        2932

        鸟枪法测序的操作方法

        1、用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA,并用Agarose凝胶电泳进行回收。

        2、对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理,然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化。

        3、进行Agarose电泳,切胶回收1kbp ~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。

        4、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中,然后转化,挑选克隆。

        5、对阳性克隆(含1kbp~2kbp Insert)进行DNA测序。

        6、对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。

        DNA测序量

        应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率),对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。

        如:对100kbp的DNA片段进行测序时,可以按以下方法进行计算:

        6倍测序量=100,000 Bases×6/600 Bases=1000个反应

        8倍测序量=100,000 Bases×8/600 Bases=1333个反应

        结果编辑

        按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序,然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段(Contig)。

        补缺工作

        结果编辑工作结束后,会发现在数个DNA大片段(Contig)间的序列没有测定,此时应该通过primer walking来测序,进行整体DNA序列的补缺工作。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序