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        4kb载体与3kb片段连接一直不长菌落

        相关实验:基因克隆:高效感受态细胞制作

        user-title

        alaalaya

        各位老师好,最近做无缝克隆一直不成功,具体过程如下,求指教。

        载体4234bp;目的片段3513bp

        ①载体线性化(50ul体系)

        载体(600ng/ul)2ul,

        EcoR I 0.75ul,Xho I 0.75ul,

        10×Q Cut buffer 5ul,

        ddH2O 41.5ul

        37℃,3h,电泳回收后浓度50ng/ul

        ②infusion(20ul体系)

        摩尔比👉载体:片段=1:2(0.03pmol:0.06pmol)

        最适载体量:0.03×4324bp×0.65=84ng

        最适片段量:0.06×3513bp×0.65=137ng

        载体 1.8ul

        片段 0.6ul

        5×CE II buffer 4ul

        Exnase II 2ul

        dd H2O 11.6ul

        37℃,30min

        ③转化

        infusion产物+50ul感受态,冰浴静置30 min;42℃热激45s,加800ul LB,200rpm,37℃,摇床1h(也试过1h30min)

        涂板,37℃培养12-16h,不长菌落

        尝试师姐做成功的片段,自己做一遍还是不长菌,按理是自己操作有问题,可是师姐看着我操作的,我到底有什么步骤遗漏了,求各位老师指教!!!

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        3 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        你热激后加的是空白的lb吗?不是带抗性的吧?如果你师姐能做成来,至少证明片段什么的没问题,那就考虑是什么液体加错了。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        可能有几个导致不长菌的原因:

        1.感受态细胞是否失活:可以在下次实验时加入阳性对照组,向同批感受态细胞中转入阳性质粒以确认其活性;

        2.抗性药物是否错误:重新确认一下重组质粒的抗性,以免用错抗性药物进行菌落筛选,导致不长菌;

        3.载体是否正常工作:可以向载体中连入其它已成功连接过的短片段,转化感受态后观察其菌落生长情况,以确定载体是否正常工作。

        user-title

        dxy_g9y5gije

        有帮助

        说实话,看操作确实没有问题

        不长菌落我觉得可以考虑一下细节上有没有问题

        第一,所用的试剂是否完好

        第二,能否确保连接成功

        第三,培养基抗性是否正确

        第四,所用设备是否满足实验条件

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