大片段的精确扩增实验

一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
灭菌水配制的下列试剂，储存在指定的温度条件下。
(1) 5mol/L 甜菜碱（SigmaB-2629 或 SigmaB-2754)
过滤灭菌，室溫保存。
(2) 10XKLA PCR 反应缓冲液，pH9.2
500 mmol/LTris 碱 (Sigma;Trizma 碱)
169 mmol/L(NH)₄SO₄
25 mmol/LMgCl₂
1%Tween20
不 用调节，pH 约 9.2(大片段扩增最佳），对于一些质粒，如 col El,pH7.9 比较适宜（见第 29章); 用 2mol/L 的 HCl 10XKLA 到 pH7.9, 不要将 pH 计直接插入到缓冲液中，以免外界 DNA 污染，可以取一小滴检测。要避免 10X 缓冲液结冰，过滤灭菌后储存于 4°C(如果缓冲液变得浑浊，用前摇匀仍可使用)。对于 Kletaq LA,Mg²⁺浓度很重要。在全长 Taq 酶扩增体系中（10XTLA),MgCl^₂ 只有7.5 mmol/L。
(3) TEN+BSA
10 mmol/L Tris-HCl(pH7.9)
10 mmol/L NaCl
0.lmmol/L  EDTA
100ug/ml  BSA
-20°C保存。
一般用 TEN+BSA 稀释模扳 DNA 至 10ng/ml(或低于），这样可以增加重复性，特别是冻存后。
2. 酶和酶缓冲液
Klentaq LA 为 50〜55U/ul(推荐的酶浓度，根据复制子的长度而不同；见 6.1 疑难解答②)。
3. 核酸及引物
(1)10/40dNTP 混合物
每种 dNTP10 mmol/L
40 mmol/LMgCl₂
每 种 dNTP 可以从 Pharmacia Biotech 购得干粉，溶解成 l0mmol/L, 储存于-80°C。一般以 500/ul 分装dNTP 混合液储存于一 80°C, 如果常用则储存于-20°C。用 dNTP 混合液比购买 dNTP(100 mmol/L) 更有利于获得高产 PCR 产物。作者没有用新购的 dUTPase 作比较，因此用 dUTP 可能有点问题。
(2)10umol/L 引物
将引物稀释到 l0pmol/L,50ul 反应体系中加入 1ul，-20°C 保存.
4. 设备
PCR 仪。
二、方法
1.冰上加入下列试剂。
10XKLA,pH9.2，有些质粒用 pH7.9                                                60ul
10/40dNTP 混合物，终浓度为每种 l00umol/L                                6ul
5mol/L 甜菜碱（终浓度 1.2mol/L), 部分质粒终浓度可达 2mol/L    156ul
H₂0                                                                                                 345ul
KlentaqLA(如果靶 DNA 小于 2kb，加 lul 即可）                             3ul
混匀
2.取出 48ul, 加入 2ul 引物，作为对照。
3.剩余的溶液中加入浓度为 l0ng/ul 基因组 DNA, 混匀。
4.每管取 48ul。
5.每管中加入上下游引物各 1ul, 也可以将上下游引物混在一起，加入 2ul。不要担心混合不均匀，因为 PCR 扩增过程中的对流足以将其混匀。
6.编制 PCR 扩增程序时，每一个循环的加热时间约 5〜10s, 有的 PCR 仪可能说明 5〜50s，不同的 PCR 仪可能有所区别。
每一个循环 92°C 50s , 63°C 10 min。按以下设置循环数。