大肠杆菌重组蛋白复性

实验步骤

 

 1.        制备包涵体

 

1)        取上述含目的蛋白菌液，4℃，6500 rpm 离心 15 min，弃上清；

 

2)        将沉淀完全重悬于 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液，反复混匀；

 

3)        在细胞裂解的过程中将重悬的溶液置于冰上以防止蛋白受热裂解，可选择超声波裂解或 French Press 法裂解细胞。其中超声波裂解细胞是更广泛应用的一种方法，但利用此方法细胞的裂解率较低，并且液不适用于大量细胞的裂解（超出 50 g）。无论选择何种方法，都必须将细胞置于冰上；

 

4)        细胞裂解后在混和液中迅速加入蛋白酶抑制剂，每 40 mL 混和液加入 5 mL 的含有 EDTA 的蛋白酶抑制剂 Cocktail Set II 或 1mL 的蛋白酶抑制剂 Cocktail Set III（选做）；

 

5)        10000 rpm 离心 10 min 收集包涵体；

 

6)        弃上清，将沉淀（内有包涵体）用 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液完全重悬；

 

7)        重复步骤 5 收集沉淀；

 

8)        将上述沉淀再次用 0.1 倍菌液体积的 1 × IB 洗涤液完全重悬，并将重悬液转移至重量已知的干净的离心管中；

 

9)        10000 rpm 离心 10 min 收集包涵体，弃上清，并将离心管倒置在纸巾上以完全除去多余的液体；

 

10)    离心管称重，减去管中以得到包涵体的净重。一般来说，OD₆₀₀ 为3 时收集的菌液，并且不溶性蛋白在细胞中的含量为 10-40% 时，每毫升菌液中有 1-4 mg 的包涵体。

 

2.        蛋白的溶解和重新折叠

 

1)      根据包涵体的重量计算所需的溶解液量，溶解包涵体使其在溶解液中的浓度为 10-20 mg/ml，溶解液按如下配方在室温下配制：

 

10 × IB Solubilization buffer       5 mL

 

ddH₂ O                                    44.5 mL

 

30% N-lauroylsarcosine          0.5 mL

 

DTT                                         50 µL

 

Total                                        50 mL

 

2)      将配制的溶解液加入收集有包涵体的离心管中，轻微混和。大的片断用枪头反复打碎；

 

3)      室温静置 15 min；

 

4)      室温 10000 rpm 离心 10 min 离心，转移上清（内有溶解蛋白）于干净的离心管中（避免碎片）。

 

3.        透析

 

1)      透析袋处理，过程如下：

 

                                  i.              把透析袋剪成适当长度（10-20 cm）的小段；

 

                                ii.              在大体积的 2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10 min；

 

                              iii.              用蒸馏水彻底清洗透析袋；

 

                              iv.              放在 1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中将之煮沸 10 min。冷却后，存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋必须戴手套；

 

                                v.              用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净；

 

2)      准备透析液（为样品的 50 倍，如样品量为 15 mL，则需透析液 750 mL，因透析两次故共需透析液 1.5 L），按以下配方配制：

 

50 × IB dialysis Buffer         30 mL

 

ddH₂ O                                  1.5 L

 

（1 M DTT ）                     150 µL

 

Total                                    1.5 L

 

3)      4℃透析至少 3 h 以上，换新的透析液继续透析 3 h 以上；

 

4)      按上步骤制备透析液，但不加 DTT;

 

5)      用不加 DTT 的透析液再透析一次。

 

4.        氧化还原以促使二硫键的形成

 

为促使蛋白的二硫键的正确形成，可以在透析液中加入氧化剂和还原剂继续透析，经常用的氧化还原剂为氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽，比较经济的方法是使用 CuSO₄ 或 NaSeO₃ ,但使用这种方法所形成的不正确的二硫键比前者高。因此本论文中使用氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽。

 

1)      如上制备透析液，但加入氧化还原剂，于4℃保存（其中还原性谷胱甘肽和氧化性谷胱甘肽的浓度分别为 1 mM 和 0.2 mM）；

 

2)      继续于4℃透析蛋白过夜；

 

3)      取样检测蛋白的活性；

 

4)      如有必要，继续于室温或37℃透析蛋白以提高二硫键的形成率。

 

另有一种替代的方法就是配制氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的浓缩液，并直接加到目标蛋白中，反应后透析再除去多余的氧化还原剂。

 

5.        阴离子交换树脂除去 N-lauroylsarcosine

 

这一步一般来说是非必需的。因为实验室中检测发现经过透析后样品中N-lauroylsarcosine 的水平只相当于溶解液中的 1%，不超过 0.003%。因此一般在用阴离子交换树脂处理之前先检测样品中的 N-lauroylsarcosine 水平。并且使用此方法还要确信目的蛋白在实验过程中不会和阴离子交换树脂结合。

 

1)      准备阴离子交换树脂，依次以浓度为 1 M 的 NaOH、ddH₂ O、4M的乙酸、ddH₂ O、50 mM的无菌 Tris-HCl（pH 7.5-8.0）清洗，并于50 mM的无菌 Tris-HCl（pH 7.5-8.0）中于4℃保存备用；

 

2)      计算所需的阴离子交换树脂量，如样品溶解液中 N-lauroylsarcosine的浓度为 0.3%，则阴离子交换树脂的浓度应为 1.5% 即每 100 mL 蛋白样品中应加入 1.5 mL 的阴离子交换树脂；

 

3)      将计算好的阴离子交换树脂加入蛋白样品；

 

4)      室温缓摇 15 min；

 

5)      用尼龙膜（0.45-1 µm）过滤除去阴离子交换树脂；

 

6)      检测样品中 N-lauroylsarcosine 的含量，如有必要重复处理，检测方法如下：

 

                                      i.              配制浓度为 0.3% 的 N-lauroylsarcosine 的储存液，并用 ddH₂ O稀释至一系列的浓度梯度；

 

                                    ii.              以同样的方法将待测蛋白样品用ddH₂ O稀释，设置ddH₂ O作为对照。每个样品稀释液的体积均为 0.5-1 mL；

 

                                  iii.              每毫升稀释液中加入 100 µL 的浓度为 1 M 的 HCl；

 

                                  iv.              短时间涡旋震荡并在室温中温育 5 min；

 

                                    v.              测定标准溶液的 OD₄₀₅ 并制作 N-lauroylsarcosine 的标准曲线，利用标准曲线对应确定待测样品中的 N-lauroylsarcosine；

 

                                  vi.              利用激光动态光散射仪检测蛋白是否复性。