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        专一性和温度、pH、激活剂及抑制剂对淀粉酶活性的影响

        互联网

        9795

        实验原理

         

        酶具有高度专一性,一种酶只能催化一种或一类底物发生反应,如淀粉酶只能水解淀粉,不能水解蔗糖。当淀粉被淀粉酶彻底水解为还原性麦芽糖和葡萄糖时,能使班氏试剂的Cu2 还原成Cu1 ,生成砖红色Cu2 O沉淀。淀粉酶的活性受温度、pH、激动剂及抑制剂、酶浓度以及作用时间等多种因素影响,因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可与碘反应生成紫色、棕色或红色络合物。通过上述特征性反应,并以蔗糖等作对照,便可观察、验证淀粉酶是否具有专一性以及它的催化活性是否受到影响。

        实验试剂

         

        1. 1%淀粉称取淀粉1g,加少量水调成糊状,加入煮沸的0.3%NaCl溶液至100ml。

        2. 1%蔗糖溶液

        3. 班氏试剂 A液:取柠檬酸钠173g,无水碳酸钠100g,加水600ml,加热溶解,冷却后稀释至850ml;B液:取结晶硫酸铜(CuSO4 ·5H2 O)17.3g溶于100ml预热的蒸馏水中,冷却后加水至150ml。将A液缓慢倒入B液中混匀置试剂瓶备用。

        4. 碘液:称取碘4g、碘化钾6g溶于l000ml蒸馏水中,置棕色瓶内贮存备用。

        5. 各种pH缓冲液

           1) pH6.8缓冲液:取0.2mol/LNa2 HPO4 溶液772ml,0.1mol/L柠檬酸溶液228ml混合即成。

           2) pH4.0缓冲液:取0.2mol/LNa2 HPO4 溶液385.5ml,0.1mol/L柠檬酸溶液614.5ml混合即成。

           3) pH8.0缓冲液:取0.2mol/LNa2 HPO4 溶液972ml,0.1mol/L柠檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9% NaCl 溶液

        6. 1%CuSO4 溶液

        7. 1%Na2 SO4 溶液

        实验设备

         

        1. 滴管、烧杯、试管(架)及试管夹。

        2. 恒温水浴箱与水浴锅。

        3. 脱脂棉、漏斗及纱布。

        4. 白瓷反应盘。

        实验材料

         

        待测淀粉酶

        实验步骤

         

        1. 唾液淀粉酶的收集与处理

           1) 制备唾液
        实验者先将痰咳尽,用自来水漱口,以清除口腔内食物残渣,再在口腔内含蒸馏水约15ml,并作咀嚼咕漱运动,3分钟后吐入垫有两层经润湿处理的脱脂纱布的漏斗内,过滤于小烧杯中备用,为与下面稀释唾液相区别,此称制备唾液。
           2) 煮沸唾液
        取上述唾液约2ml,盛入1中号试管中,置沸水浴煮沸5分钟备用。
           3) 稀释唾液
        调整唾液淀粉酶活性,使之在pH6.8、37℃和既无激动剂又无抑制剂条件下,作用5min,水解淀粉至红色糊精为宜。具体做法是取12凹白瓷反应板一块,按下列步骤操作:
              a. 第1排每凹各加1滴制备唾液,12 、13 、14 凹分别加生理盐水1、2、3滴,用滴管采用抽吸法,由稀到浓(14 →12 )小心混匀各凹,勿使溅入相邻凹中。每混匀一凹便取其1滴放入同列的2排凹中,剩余稀释唾液应全部放回原凹中。
              b. 在盛有不同稀释度唾液的第2排各凹中,均加入4滴缓冲液(pH6.8),2滴1%的淀粉液和2滴蒸馏水,用a混匀法充分混匀,置37℃下5min。
              c. 在第2排各凹中加I液一滴,混匀,观察比较各凹颜色,以浅棕-红色对应的稀释倍数,用生理盐水稀释3ml制备唾液备用。

        2. 唾液淀粉酶的专一性以及温度、pH、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活性影响的观察

           1) 取试管3支编号,按下表1操作

        表1 唾液淀粉酶专一性的实验观察

        试剂

        试管

        pH6.8缓冲液

        1%淀粉溶液

        1%蔗糖溶液

        制备唾液

        煮沸唾液

        1

        20滴

        10滴

        5滴

        2

        20滴

        10滴

        5滴

        3

        20滴

        10滴

        5滴

        将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入班氏试剂20滴,再放入沸水浴中煮沸约15分钟,观察各管颜色反应,并说明原因。

           2) 温度影响酶促反应的实验观察

             a. 取试管3支编号,按下表2操作:

        表2 温度影响酶促反应的实验观察

        管号

        试剂

        1

        2

        3

        1.pH6.8缓冲液

        20滴

        20滴

        20滴

        2.1%淀粉溶液

        10滴

        10滴

        10滴

        3.预热5min

        37℃水浴

        沸水浴

        冰浴

        4.直接加入稀释唾液,立即混匀、计时

        5滴

        5滴

        5滴

        5.保温10min

        37℃水浴

        沸水浴

        冰浴

              b. 将一、二管移入冰水浴中,待各管温度一致后速向各管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明温度对酶促反应的影响。

           3) pH影响酶促反应的实验观察

              a. 取试管3支编号,按下表3操作:

        表3 pH影响酶促反应的实验观察

         

        pH4.0缓冲液

        pH6.8缓冲液

        pH8.0缓冲液

        1%淀粉溶液

        稀释唾液

        试管1

        20滴

        10滴

        5滴

        试管2

        20滴

        10滴

        5滴

        试管3

        20滴

        10滴

        5滴

              b. 将上述各管混匀后,置37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观察各管颜色的区别,并说明pH对酶促反应的影响。

           4) 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

              a. 取试管4支编号,按下操作:

        表4 激动剂和抑制剂影响酶活性的实验观察

         

        pH 6.8

        缓冲液

        1%淀粉溶液

        蒸馏水

        0.9%NaCl

        1%

        CuSO4

        1%Na2 SO4

        稀释唾液

        1

        20滴

        10滴

        10滴

        5滴

        2

        20滴

        10滴

        10滴

        5滴

        3

        20滴

        10滴

        10滴

        5滴

        4

        20滴

        10滴

        10滴

        5滴

              b. 将上述各管放入37℃水浴中保温10分钟,然后每管加入碘液1滴,混匀后观各管颜色的区别,并说明激动剂和抑制剂对酶促反应的影响。

        注意事项

         

        1. 反应试管应清洗干净,不同酶液、试剂及其滴管不能交叉混用;

        2. 使用混合唾液,或通过预试选出合适的唾液稀释度,效果更为显著。

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