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        淀粉酶的活力测定及专一性实验

        互联网

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        一. 目的

        了解淀粉酶对不同底物的专一性

        掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法

        二. 原理

        酶与一般催化剂最主要的区别之一是它具有高度的专一性。所谓专一性指的是一种酶只能对一种化合物或一类化合物(通常在这些化合物的结构中具有相同的化学键)起一定的催化作用,而不能对别的物质发生催化反应。

        例如,淀粉酶只作用于淀粉中的a-1,4葡萄糖苷键,而不能作用于蔗糖分子中a-D-吡喃葡萄糖的C1和b-D-呋喃果糖的C2之间的糖苷键。

        蔗糖无还原性,淀粉的还原性也极小,它们对3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)呈阴性反应,而唾液淀粉酶(主要含a-淀粉酶)水解淀粉后的产物则为还原性糖,与DNS试剂共热呈阳性反应,产生红棕色。据此可以检验蔗糖和淀粉有无被唾液淀粉酶水解,从而了解酶作用的专一性。

        酶活力也称酶活性,是以酶在最适温度、最适pH等条件下,催化一定的化学反应的初速度来表示。

        本实验是以一定量的唾液淀粉酶液,于37°C、pH6.8的条件下,在一定的初始作用时间里将淀粉转化为还原糖,然后通过与DNS试剂作用,比色测定,求得还原糖的生成量,从而计算出酶反应的初速度,即酶的活力。这里规定,一个淀粉酶活力单位定义为在37°C、pH6.8的条件下,每分钟水解淀粉生成1mg还原糖所需的酶量。

        三. 实验材料及设备

        1. 材料

        唾液

        2. 仪器

        分光光度计 恒温水浴 沸水浴

        3. 器材

        刻度试管: 25mL×10

        容 量 瓶: 100mL×1

        移 液 管: 1mL×4 2mL×2

        烧 杯: 250mL×1

        滴 管: 2

        洗 耳 球: 2

        洗瓶、试管架、移液管架、玻棒:各1

        四. 试剂的配制

        1. 淀粉溶液(0.5%)

        称取5g可溶性淀粉,溶于1000mL热水中。(临用前配制)

        2. 蔗糖溶液(1%)

        3. 3,5-二硝基水杨酸 试剂 (DNS试剂)

        将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中(不适宜用高温促溶),接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液,混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解后,定容至1000mL。暗处保存备用。

        4. 磷酸缓冲液(0.2mol/L,pH6.8)

        5. NaOH溶液(6mol/L)

        6. NaCl溶液(0.3%)

        五. 操作步骤

        1. 唾液淀粉酶的制备

        (1) 提取:实验者先用水漱口清洁口腔,然后含一小口(约5mL)蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。

        (2) 过滤:将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。

        (3) 稀释:取滤液1mL,用水定容至100mL。作为淀粉酶的样品液。

        (由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同,稀释倍数可以是50~300倍,甚至超过此范围。)

        2. 唾液淀粉酶的专一性实验

        取4支 试管 ,按表一编号并操作,记录所观察到的颜色。

        3. 唾液淀粉酶活力的测定

        取25mL刻度 试管 5支,按表二编号并操作,记录实验结果。

        六. 结果处理

        1. 解释表一的实验结果。

        2. 根据表二的实验结果,并利用实验四“3,5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量”中制作的标准曲线,计算每毫升新鲜唾液含有淀粉酶的活力单位。

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