海洋不同生境总基因组DNA的提取

实验原理

 

由于环境样品种类繁多、组成复杂、物化性质多变，使得传统的对纯培养微生物提取DNA的方法很难直接应用到环境样品的研究中。近几年来己有多个实验室对从环境样品中提取DNA的方案进行了优化和评价。

目前从环境样品中提取DNA的方法大体上分为两类：一类是原位(in situ)裂解法，直接裂解土壤样品中的微生物细胞，抽提DNA，该方法的优点是：操作容易、成本低、DNA的得率高，代表性好。缺点是：提出的DNA片段较小，且用这种方法提取的土壤、污泥等样品中通常含有腐殖酸(humio aoid)和棕黄酸(fulvic acid)等杂质，这些物质可对内切酶消化、PCR扩增等后续操作产生强烈的影响；另一类是异位(ex situ)裂解法，先采用差速离心等物理方法将微生物细胞从样品中分离出来。再用较温和的方法抽提DNA。近两年用得最多的是尼可登介质密度梯度离心分离微生物细胞，然后包埋在低熔点琼脂糖中裂解，脉冲凝胶电泳回收DNA，此方法可获得大片段的DNA且纯度高。但此方法优势在于获得的DNA纯度高，杂质少。缺点为操作繁琐，成本高，DNA得率低，该方法抽提到的DNA主要来自于和土壤颗粒附着力较弱的微生物个体。

实验试剂

 

1. DNA抽提缓冲液组成

    100 mmol/ L Tris-HCl (pH 8. 0)

    100 mmol/ L Nat-EDTA (pH 8. 0)

    100 mmol/ L Na₃ P0₄ 缓冲液(pH 8. 0)

    1 .5 mol/ L NaCI

    1%CTAB

    115℃高压灭菌3 0 min后备用

2. 其它生化试剂(均购自上海生工)

    6 mol/L NaI

    5 mol/ L NaCI

    20%(W/ V) SDS

    10 mmol/ L磷酸钠盐缓冲液(磷酸氢二钠9.32 mL)

    PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)

3. 消化酶类(购自上海生工)

    25mg/mL proteinase K

    25mg/mL lysozyme

4. 试剂盒：

    TaKaRa Ex Taq试剂盒[TaKaRa]

    PowerSoil DNA Isolation Kit [MO BIO公司]

    玻璃粉DNA纯化试剂盒[上海生工]

实验设备

 

3.75L发酵罐[Bioengineering公司]

85-2型恒温磁力搅拌器[上海同乐仪器厂]

FA 16045电子天平[上海天平仪器厂]

FPLC层析系统[Pharmacia公司]

Milli Q超纯水装置[美国Millipore公司]

PCR扩增仪[美国PE公司GeneAMP PCR System 2400]

THZ-C恒温振荡仪[江苏太仓实验设备厂]

UV-754紫外分光光度计[上海安亭科学仪器厂]

X-射线观察灯[上海医疗器械五厂]

超声粉碎仪[宁波电子仪器公司]

垂直板状凝胶电泳仪[Phamarcia Hoefer Biotech. Ltd.]

蛋白电泳仪[Phamarcia Hoefer Biotech. Ltd.]

电热恒温水浴锅[上海医学器械三厂]

冻干机[荷兰Sinijiders公司]

二氧化碳孵箱[Heraeus公司]

高速冷冻离心机[日本日立公司]

隔水式电热恒温培养箱[上海跃进医疗器械一厂]

水平潜水式电泳槽[上海精益有机玻璃制品仪器厂]

台式高速离心机[上海安亭科学仪器厂]

微波炉 [日本夏普公司]

微量移液器[法国Gilson公司]

旋涡混合仪[上海医科大学仪器厂]

真空泵[美国Millipore公司]

紫外透射反射分析仪[上海长明光学电子仪器厂]

实验材料

 

土壤样品

海水样品

海泥样品

实验步骤

 

1. 海洋岸边土壤、海水与沉积物DNA提取方法

NaI/玻璃粉方法：

   1) 0.25 g样品，加生理盐水0.5 ml混匀，再加入6 mol/L NaI 0.6ml，充分混匀；

   2) 100℃水浴30 min裂解细胞或芽抱，其间每5min混匀一次；

   3) 10 000 r/ min离心5 min，取上清，加入3倍体积的Solubilization Solution和每5 µgDNA加入10 µl Golden Beads Suspension混匀，室温静置5 min；

   4) 12 000 r/min 1 min吸去上清，不要移走Golden Beads；

   5) 加入500µLWash Solution，轻弹悬浮，12 000 r/min 30 s，小心移去上清；

   6) 重复5一次；

   7) 离心，吸去上清，离心管开盖倒置，室温保持5 min，不要使Golden Beads完全干燥；

   8) 加入20一40µL Elution Buffer、TE或者水(pH>7)悬浮Golden Beads室温放置2 min，间或轻弹混匀；

   9) 12 000 r/min 1 min，小心移取上清至洁净1.5 mL离心管；

   10) 重复9一次，离心管中样品即为所得。

溶菌酶与蛋白酶K法：

   1) 取2g泥土样品(湿重)，同时加入5 mL DNA抽提缓冲液和proteinase K 50µL混合均匀，于摇床中水平振荡(37℃，180 r/ min)约30 min；

   2) 加入1 mL TE和溶菌酶320 µL，继续振荡30 min；

   3) 加入0.5 mL 20 %( W/ V) SDS，经65℃水浴30 min(后加入2%酸洗的PVPP (polyvinylpolypyrroli2done)，6000 g离心10 min，将上清液移入新的离心管；

   4) 沉淀重复抽提2次。步骤为：往沉淀中加入DNA抽提缓冲液及20 %( W/V) SDS，65℃水浴10 min，6000 g离心10 min；

   5) 收集3次抽提的上清液于同一离心管中，加入RNase A(终浓度为200 µg/mL)，在37℃下作用15 min；

   6) 加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液轻轻混匀，15000 g离心15 min；

   7) 将上层水相移入新的离心管，加入0. 6倍体积异丙醇，于一20℃中沉淀1 h；

   8) 上柱，每次加700 µL，全部过完后，加50 µL W1，洗涤两次；

   9) 加换管，洗涤一次，空管离心2 min；

   10) 换新Eppendof管，标记，离心1 min，收集。

试剂盒方法(玻璃珠法)

   1) 加0.25 g环境样本于PowerBead管，轻柔旋涡混匀；

   2) 检查溶液C1，若有沉淀，60℃加热溶解；

   3) 加入60µL C1颠倒数次或短暂旋涡；

   4) 固定PowerBead管于旋涡仪上最大速度10 min；

   5) 检查PowerBead管能否在离心机上自由旋转(不能有刮擦)，10000g离心30 s(注意不能超过10000 g，否则管会破裂)；

   6) 转移上清至一清洁收集管(己提供)，注意：上清共约400-500µL，可能含有土壤颗粒；

   7) 加入250µL C2，旋涡5 s，4℃孵育5 min，室温离心1 min (10000g)；

   8) 转移不超过600µL的上清(避免取到颗粒)至另一清洁2 ml收集管；

   9) 加入200µL C3，短暂旋涡，4℃孵育5 min，室温离心1 min ( 10000g)；

   10) 转移不超过750µL的上清(避免取到颗粒)至另一清洁2 mL收集管；

   11) 加入1200µL C4至上清，旋涡5 s；

   12) 取675µL至Spin Fitter中，室温离心1 min (10000 g)，重复，将所样品全部上柱滤过。注意：每个样品都需要三次上柱，弃滤出物；

   13) 加入500 µLCS，10000 g离心30 s，弃滤出物，室温离心1 min (10000g)

   14) 仔细将吸附柱放入一个清洁的收集管，不要将CS洒上柱子；

   15) 加100µLC6到滤膜中心，也可用灭菌的DNA free的PCR级水，室温离心30 s(10000 g)；

   16) 弃柱，管中DNA即可用于下一步实验，建议贮存于-20℃至-80℃。

2. DNA的分光光度计检测

将4种纯化方法纯化后的土壤DNA各取20µL，用蒸馏水稀释至400µL。以蒸馏水做空白，在UV-754紫外分光光度计上测定OD 260， OD 280， OD 230三个数值。根据核酸定量经验公式计算DNA含量：

对于纯DNA，1个OD 260 =50g/ml DNA，因此DNA含量应为：

50 µg/mL X OD 260 X稀释倍数。

并分别算出A260 / A230及A260 / A280值。

3. DNA的PCR检测

将不同方法提取的土壤、海水、沉积物DNA样本进行l0X倍比稀释成1，10，100，1000，10000倍后作为模板，使用细菌16 s rDNA通用引物进行PCR扩增。

引物：27f：  5'-AgA gTT TgA TCC Tgg CTC Ag-3'

           1492r：  5’-TAC ggT TAC CTT gTT ACg ACT T-3'

   1) 反应体系(50µL体系)：

       TaKaRa Ex Taq (U/µL)    0.5 µL

       I0 X Ex Taq Buffer(Mg² plus)   5 µL

      dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)   4 µL

      模板DNA       1 µg

      引物1(20 µmol/L)   1 µL

      引物2(20 µmol/L)   1 µL

      ddH₂ O 加至终体积   50 µL

   2) PCR反应循环参数：

      95℃ 5 min；

      94℃ 40 s、55℃ 40 s、72℃ 90 s，共30个循环；

      72℃ 7 min。

   3) 反应结束后，置4℃保存。琼脂糖凝胶电泳，EB显色，紫外成像分析。