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        动物总RNA的提取

        互联网

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        实验目的
          学习从动物组织中提取RNA的原理和方法。
        实验原理
          RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度变性剂TRIzol,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶,所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后,除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片,通过氯仿、异丙醇等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
        实验 仪器 和材料
        低温冷冻离心机、烤箱、制冰机、移液器、冰箱,水平电泳槽、电泳仪、匀浆器、TRIzol、氯仿、异丙醇、75%乙醇(DEPC H 2 O)配制、DEPC H 2 O
        实验步骤
        1.  取50-100mg(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml匀浆器中,加入1ml TRIzol充分匀浆,室温静置5min。
        2.  加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
        3.  4℃离心,12000g×15min,取上清置另一1.5ml离心管中。
        4.  加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
        5.  4℃离心,12000g×10min,弃上清。
        6.  加入1ml75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃离心,7500g×5min,弃上清。
        7.  晾干,加入适量的DEPC H 2 O溶解(65℃促溶10~15min)。
        8.  快速电泳检测RNA完整性。
        注意事项
            1.样品量和TRIzol的加入量一定要按照步骤1的比例,不能随意增加样品量或减少TRIzol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。
            2.实验过程中必须严格防止RNase的污染。
        3.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
        4.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗。
        5.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC在37℃处理12h以上,然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的 试剂 ,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22um滤膜过滤除菌。
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