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        免疫组织化学实验操作顺序

        丁香园

        3688

        1. 石蜡切片脱蜡和水化后,用PBS(PH7.4)冲洗三次,每次5分钟。

        PBS配制 (2000ml)PH7.4

        氯化钠: 17g

        磷酸二氢钠:0.4g

        磷酸氢二钠:6.3g

        2. 根据每一种抗体的要求,对组织抗原进行相应的修复。

        我采用压力锅进行抗原修复,取一定量的修复液于压力锅中,加热至沸腾,将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,盖上锅盖,扣上压力阀,继续加热至喷气,从喷气开始计时,2分钟后,压力锅离开热源,冷却至室温(也可以稍冷后,在自来水龙头下加速冷却)。取出玻片,先用蒸馏水冲洗两遍(用蜡在组织周围划圈,防止抗体跑散,但圈要大一点),之后用PBS(PH7.4)冲洗三遍。每次5分钟。

        柠檬酸缓冲液的配制(PH6.0)

        0.1M柠檬酸:(4.2g+200ml蒸馏水)

        0.1M柠檬酸三钠 (14.7g+500ml蒸馏水)

        取柠檬酸三钠41ml+柠檬酸9ml加入450ml蒸馏水中,总量为500ml即可。

        3. 配制3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,孵育十分钟。

        PBS90 ml+30 %过氧化氢10 ml,现用现配并摇匀,盖上盖子,防止见氧分解挥发。

        4. PBS 冲洗三次,每次5分钟。

        5. 滴加4 %羊血清封闭,室温30分钟,以减少非特异性染色。

        PBS 10 ml+正常羊血清400 ul

        6. 甩去羊血清,根据不同的项目配制并滴加不同的一抗,浓缩型的抗体一定要在购买后先用已知的阳性片做梯度实验,根据结果情况找出最佳稀释浓度再用到临床诊断。

        工作液也应该在购买后先用已知的阳性片检测抗体的染色效果,直接滴加即可。每次还应带上阳性对照和阴性对照,以保证结果的可靠性。每张切片滴加足够量的一抗并放入湿盒,防止切片干燥影响结果,室温孵育2小时。

        抗体稀释液的配制 牛血清白蛋白:2mg

        叠氮钠: 10~20ml

        双蒸水: 10ml

        7 . PBS冲洗三次,每次5分钟。

        8. 滴加二步法EnVision TM孵育30分钟。

        9. PBS冲洗三次,每次5分钟。

        10. 甩去PBS液,每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下观察,阳性信号为棕黄色或棕褐色。一般显色时间为5分钟左右,终止反应,自来水充分冲洗。

        11. 苏木素复染,0.1%盐酸酒精分化,氨水返兰或自来水返兰(自来水返兰时间要稍长些,应该在显微镜下看以下苏木素复染情况),自来水冲洗。

        12. 梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,阅片并总结染色结果。

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