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        【分享】荧光定量PCR详细流程和问题解析(一)

        丁香园论坛

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        前一段时间在百度中搜索,发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过,考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了,做的实验以及解决的问题远比五年前多了,因此利用过年的时间,写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想,无论对错,都是希望对相关的人员有些参考价值。

        荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了,我就不细说了,主要是写一些有人问过的事,希望写的内容是大家都关心的。

        普通PCR与荧光定量PCR技术区别?

        简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。

        前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。

        Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择?

        从实验成本来讲,Sybr Green是最好的,基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可,其信号强度也很好,还可以进行融解曲线分析等,但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测,另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果,当然也有一些技术解决这些问题,后面会讲到。对于研究人员来讲,如果需要检测的基因很多,而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求,则Sybr Green是最好的选择。

        如果需要进行多通道实验,即在一个反应管中进行2种或以上的反应,则要选择其他的方法,最常用的是Taqman、Molecular beacon,这两种都是探针的方式,由于增加了探针的特异性,因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线,不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术,以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高,有时设计的探针并不合适,有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题,据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低,但只是据说。

        另一种值得一提的是LUX探针,它也可进行多通道实验,但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能,因此只能是一种折中的方案,如果不考虑多通道实验,则不如Sybr Green法.

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