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        DNA重组实验

        互联网

        4172

        实验目的

        要获得表达的基因AKP,必须构建重组子。

        我们通过以下的方法构建重组DNA,转入受体菌,就可以表达出目的基因。

        之所以重组子要进入细胞,是因为大肠杆菌中有修饰的机制,可以在转入表达载体时不被降解,高效表达。

        实验原理及过程

         

         

        实验步骤

        实验原理

        1 双酶切(单位:μL)

        管 核酸 buffer ddH2 O Hind III BamH I

        1 15(AKP) 2 0 2 1 

        2 10(质粒)2 5 2 1

         37℃酶解3小时

        在此体系中,我们用Hind III 和BamH I这两种限制性内切酶来切目的基因,这样会产生两个不同的粘性末端,这时候如果插入目的基因,可以保证目标序列插入的方向并提高效率。

        2 酶切产物的纯化和回收

         

         

        1)

         

        向酶切体系的管中加入60 μl 溶液A(6mol/L NaClO4, 0.03mol/L NaAc,pH 5.2)和 15 μl溶液B(3mol/L NaAC, pH 5.2),充分混匀。

        高盐上样。

        2)

         

        将溶液置于离心柱中,静置5min。

        这是一个类似于吸附层析的过程。DNA会特异的吸附于硅质的薄膜上,故可以起到分离的效果。

        高盐能促进吸附。

        3)

        8,000 rpm,离心30秒,弃液体。

         

        4)

         

        加入500 μl溶液C(用时一定按照 1:2 的比例加入无水乙醇,混匀后使用)于离心柱中, 8,000 rpm,离心30秒,弃液体。

        此步骤是洗涤。

        5)

        重复步骤4。

        再次洗涤。

        6)

        12,000 rpm,再离心60秒,去残余的乙醇。

        将剩余的乙醇尽量完全甩出去。

        7)

        超净台中凉干。

        挥发乙醇。

        8)

         

        加入25μl 溶液D(TE) ,500C 保温5min。 

        此步骤是解析。
        让DNA释放到溶液中,离心的方法可以将DNA纯化。
        低盐有利于解吸附。

        9)

        12,000 rpm离心2min,管底溶液即为所需的DNA。

         

        10)

         

        1%琼脂糖,0.5 x TBE ,5 μl 样品,80V 恒压电泳,检测AKP和载体的相对浓度。

        为了使质粒和目标基因浓度比例在1:3到1:10之间,所以先用电泳的方法预先了解一下样品的浓度,然后再连接。 

        当质粒与目标基因比例合适时,可以由高的连接率,有效降低自连的发生。另外,酶的浓度过高还会有星号活力。

        3连接(单位:μL)

         

        AKP 质粒 buffer ddH2O T4DNA连接酶

         15 2 2 0 1

        14℃连接过夜,之后-20℃保存,用于转化受体细胞。

        由电泳结果显示,我的质粒切得并不好,所以我用了本组另一名同学的质粒。他的质粒浓度高且纯净,所以用2μL就足够。我总共用20μL体系。

        4目的基因转化及筛选

         

        将连接好的质粒转入菌NovaBlue中(两个阴性对照),具体方法见试验一报告。

         

         

        培养NovaBlue要用1/1000的Tet。

           在预制的LB琼脂平板上,加40μl Xgal(20mg/mL )和40μl IPTG(20mg/mL)溶液,均匀涂布于琼脂平板表面。

           将复苏后的菌液离心,抽出0.8mL上清,剩余的细胞和上清液混匀,取100μl细胞悬液涂布在上述含Tet,Carb抗生素的培养皿中,平板向上静置30min,倒置培养过夜。

        因为NovaBlue中含有f’质粒,它是抗Tet的,加入1/1000的Tet可以提供一个竞争压力,才能使这个质粒不丢失,这个菌株才能在有Tet的培养基中生长。 

        NovaBlue编码Tet诱发的promoter的RNA polymerase,培养基中有Tet,而petBlue中的Tet诱发的promoter可以按其启动方向转录出lacZα肽,NovaBlue中又含有lacω肽。这样就可以用互补α筛选出重组菌。 

        Xgal和IPTG较贵,只涂在培养基的表面,可以节省成本。 

        之所以将复苏后的菌液离心,抽出0.8mL上清,剩余的细胞和上清液混匀,取100μl细胞悬液涂布是因为重组成功的菌数量是很少的,这样可以增加平板上的菌的数量,有利于筛选出我们要的重组子。

        5重组子的筛选

         

        1)

         

        质粒DNA提取

         方法同实验二

         挑取重组子是要挑取蓝斑周围的白斑

        很多白斑的产生都是因为Xgal或IPTG之一没有涂均匀,而蓝斑周围的白斑很可能是因为重组子造成的,这样是假阳性的几率会比较小。

        2)

         

        酶切(37℃,1h) 

        重组质粒

         

        buffer

         

        ddH2O

         

        4μL

         

        1μL

         

        2μL

         

        BamHI

         

        HandIII

         

        2μL

         

        1μL

         

               

        酶切结果可以分析是否是真阳性。

         具体分析见电泳结果分析

         

        3)

         

        电泳分析重组质粒

         1%琼脂糖,0.5xTBE, 80V恒压电泳

         未酶切质粒(用未重组的质粒作为Marker) 

        3μl质粒 + 0.5 μl 10 x loading 0.5 μl SYBR 

        酶切质粒(用标准DNA分子作为Marker)  

        8 μl质粒 + 1 μl 10 x loading 1 μl SYBR

        电泳跑两排,前面的跑切过质粒,后面的跑没切过的质粒。因为没有被切过质粒分子量大,跑得慢,所以这样就不会追上前面的,这样可以电泳更长的时间,增大分辨率。

         

         

        4)

         

        重组子转化表达菌株 

        取电泳检验过得真阳性菌提出的质粒做感受态(菌用DE3placI),复苏后涂平板,平板上要加葡萄糖和Cam,Carb。

         overnight

        葡萄糖可以抑制lacI本底表达。 

        DE3placI是含有T7RNA polymerase,而petBlue含有T7promoter,这个方向的转录可以才可以按正确的顺序表达目的蛋白。

         DE3placI有Cam的抗性基因。Cam既可以稳定petBlue的f1区,也可以竞争抑制杂菌。


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