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        请教有关测序的问题

        丁香园论坛

        2410
        我刚从生工测序回来,样品基因片段是用PCR扩增出来,约2.1Kb。扩增片段两端的酶切位点为Nhe1和Xho1,扩增这个片段的引物是这样:
        Ck-fullNX-F: 5' GTG CTA GCC ATG AAC AAT CCA TGG TC 3'
        Ck-fullNX-R: 5' GCG CCT CGA GCT ACA GAG ACT TAA AG 3'

        接在pcDNA3.1(+)的 Nhe1和Xho1之间。连接克隆后经酶切和PCR验证都完全正确。利用pcDNA3.1(+)的T7 promoter primer 和BGH引物从两端测序,现在我姑且将T7 promoter primer 的这一端定为上游,将BGH的这一端定义为下游。

        从回来的测序结果中能够找到下游的测序引物和PCR扩增这个片段的引物,可是无论如何找不到上游的载体序列和PCR引物。

        测序结果如下:
        TCCATGGTCCAACTCCAGCTCAGCTTTTGGATGTCCCATTCAGATCCCAAAGCAGAATAGTAATGTACCACCTTCCTTACCAGTACCTGTAGGAGTTTTTGGGGTGCCTCTGCCATTAGGCTGCAGCAATCAGATGGCTTTCTGTGCACCAGAACTGACTGACAGAAAGCCTGAGCATGAGCAGAAAGTGTCCAAGAGGCTGAATGACAGAGAAGAGGACAAGGATGAGGCAGCAGCATGCAGCTTGGACAACCAATATGACAGAAAGATCCGACCTTGCATTGATCTTGTTGACAGCCTGAGAAAGCTTGATATAGGAAACGACCTGATGTTGCCTGCAATCGCAGTGATTGGAGACCGGAACTCTGGGAAAAGCTCTGTCCTTGAAGCTTTGTCTGGTGTTGCTCTTCCTAGGGACAAAGGTGTCATTACTCGCTGTCCTCTGGAACTTAAACTGAAAAAAATGACAGCTCCGCAGGAATGGAAAGGGGTAATTTATTACCGCAACACAGAAATACAGCTCCAGAATGCATCAGAGGTGAAGAAAGCAATAAGAAAAGCCCAAGATATAGTGGCTGGCACTAATGGTAGCATTAGTGGAGAACTAATTTCCCTTGAAATCTGGTCTCCTGACGTCCCAGACCTGACACTAATTGATCTTCCTGGAATTGCCAGAGAGGCCGTGGGCAACCAGCCACAAGATAATGGCCAACAGATCAAAACACTACTTAAAAAATATATTGGCTGCAAAGAGACAATCATTGTGGTAGTGGTACCATGTAATGTGGATATTGCAACAACAGAAGCGCTGAAAATGGCTCAAGAGGTGGATCCCACAGGAGAAAGGACGCTTGGGGTCCTCACTAAACCAGACCTAGTGAACGAAGGAACTGAGGAGACTGTCCTTAAGATAGTACAAAACGAGGTCATCCCACTCAGAAAAGGTTATATGATTGTGAAATGTTATGGGCAAATGGACTTCTGCAACGAATTGTCCTTCACCTCCACAATCCAGCAAGAGAGAGAATTCTTTGAGACTCACAAACATTTCAGCACTCTTCTGGATGAAAATAAGGCTACTATCCCACATCTGGCAAATAAGCTTACAGATGAACTTGTGGGACGTATTATTAAAACTTTGCCTGCAATAGAGAAGCAAGTACATGATGCACTGCAACAAGCAAAGAAGGAACTACAAAAGTACACACAAAGCACACACCCAACTGTCAGCGATAAGACGATTTTCCTTGTGGGGTTGATCAAAGCGTTTAATGAAGACATCTCTCAGACAATGCATGGAAAGGAATCCTGGTTTGGAAACGAAATCAGACTGTTTCCAAAAATCCGCAGAGAGTTTCGGACATGGGGAGTAAAGCTCCTGGAGAGCTCTGCCAAAGTTGAAGAAATCGTATGCAGTAAATTGCCCAAATATGAAGACCAGTACCGCGGACGGGAGTTCCCAGACTTTATCAGCTACTGGACATTTGAGGACATTATAAAAGAGCAAATTACGAAGCTGGAGGAGCCAGCTGTTGCGATGCTGAACAAAGTGATCTATATGGTTGAAGAGAAATTTTTGCAGCTGGCTAACAAGCGTTTTGCTAATTTTCGGAACTTAAACAACGCTGCTCAGGCCAGAATTGGTTGCATTAGTGACAGACAAGCAACGACTGCGAAAAATTGCATCCTGACTCAATTTAAAATGGAGAGAATTATATACTGCCAGGATAACATCTACACAGATGATTTAAAAGCTGCCAGGGCAGAAGGCATCAGCAAAGATACAAAAATCAAAGACCTTGCTTTTGGATGTGCTTCACGTCAATGTCCCAGCTTTGCCCTGGAAATGGTTTCTCACGTAAAGGCCTATTTCACTGGAGCAAATAAACGCCTGAGCAATCAGATTCCTCTGATCATCCTCTCTACTGTCCTTCATGACTTTGGAAATTATTTGCAGACCTCAATGTTGCATCTCTTGCAAGGAAAAGAAGAAATAAACTATTTACTCCAGGAAGATCATGAAGCTGCTAACCAGCAGAAGTTACTGACCAGCAGAATTAGTCACCTCAACAAAGCCTACCAATACCTGGTAGACTTTAAGTCTCTGTAGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAG

        标为红色的为我PCR扩增该片段的下游引物位点(注:因为是下游引物,所以从序列上是引物的反向的互补),红色后面的是载体序列,这说明下游的测序结果是完全正确的。可是从上游的第一个测序反应结果中怎么也找不到我PCR扩增该测序片段的上游引物,也找不到载体的序列。
        那么我可不可以就认定他们的第一个测序反应有误呢?

        与生工测序部的人说明这一情况,我不知道他们是怎么回事,也不明白我的意思,看他们是怎么回复的:“Ck-fullNX-R: 5' GCG CCT CGA GCT ACA GAG ACT TAA AG 3'在31-PN54.2(CKMX)BGH的56-81bp,只是序列上有些出入,您的这个克隆估计是非特异条带克隆的结果,建议您重新挑一个克隆送样测序 ....” 我都已经告诉他们了,下游引物在测回的序列上找到了,序列上也没有什么出入,因为引物5‘末端接上了酶切位点,片段扩增出来后酶切连接到载体上的,酶切位点Xho1(CTCGAG)是在的,酶切位点后的保护碱基被切掉了,所以下游的31-PN54.2(CKMX)BGH反应结果是完全正确的。那么我先不论我的片段是否是非特异的扩增,既使是非特异的扩增,既然我克隆后酶切、PCR验证都正确,在序列上至少应该找到酶切位点 Nhe1 (GCTAGC)序列和载体序列吧。

        我现在要求他们将以T7 promoter primer 为测序引物的第一个测序反应重测,我这样的要求应该是合理的吧?

        我感觉生工的服务真的是有点问题,问题EMAIL反馈给他们后,也没人回,打电话过去后,说:“我查查”。然后又要我重发EMAIL。现在他们说上海停电,这个星期不上班,真让我抓狂,大半个月过去了,要不是为了省事我都自己买试剂盒来测了。

        还请有经验的兄弟帮我看看这个测序结果,是不是应该认定测序公司测序结果有问题。我又该怎么应对这样的情况呢?
        我很急,多谢啦!
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