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        测序酶进行标记测序反应

        相关实验:双脱氧法 DNA 测序实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1.  对于每个单链模板:将下列试剂混合于0.5 ml 微量离心管中

        (1)0.5 pmol 单链DNA模板

        (2)0.5 pmol 引物

        (3)1 μl 10×测序酶缓冲液

        (4)加水至10 μl

        (5)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡)。于65℃温育6 min,然后于37 ℃温育20 min,转到步骤3。
         
        2.  对于每个双链DNA模板:以下列混合液重溶含0.5 pmol 变性双链模板的干燥沉淀物。

        (1)1 pmol 引物

        (2)1 μl 10×测序酶缓冲液

        (3)加水至10 μl

        (4)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡),于37℃温育30 min,然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。
         
        3.  当引物正和模板退火时,对应每个待测模板,分别标记好A、C、G、T 4个微量离心管。

         
        测序酶进行标记测序反应
        DNA测序用酶的特性
         
        3.  分别加入2.5 μl A、C、G、T 测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部

        4.  在临用前,才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~ 2 U 测序酶/μl,置于冰浴。
         
        5.  将下列试剂加入已退火的引物和模板中

        (1)2 μl  标记混合物

        (2)0.5~1.5 μl  10 mCi/ml[α-32P]dATP

        (3)2 μl  稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液

        (4)总体积在14.5~16 μl,于25℃(室温)温育5 min。
         
        6.  加入3.5 μl 标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。

        7.  用吸管上下抽吸轻轻混匀,对 A、C、G、T 管重复此过程,每次均需更换吸头,于37℃温育5~10 min。
         
        8.  加入4 μl 终止/加样染料液,于95℃水浴2 min,然后置于冰浴。

        9.  每样品各取2~3 μl 加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。

        来源:丁香实验

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