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        E.coli genomic library construct 求教

        丁香园论坛

        756
        最近我在做一个E.coli genomic library construct,遇到一些问题,向论坛上的大侠请教。请帮忙看看问题出在哪里。万分感谢!

        我的方法流程如下:
        1。用SDS和蛋白酶K提取E.coli genomic DNA (用的是E.coli的一个突变菌株)
        2。insert: Sau3AI digest E.coli genomic DNA, partail digestion, to get 2kb-5kb, 这一步我摸过酶切时间梯度,用0.1unit Sau3AI,40ul 反应体系,约3ug genomic DNA, 部分酶切可得到约1ug的smear片断。
        3. vector: pBR322 BamHI digestion (注:我的genomic DNA 和 Vector pBR322 都是手提的,没用试剂盒,从酶切效果来看,还可以。) 1%gel切胶回收用的 是鼎国的kit。
        4. ligation: T4 ligase(Takara company), insert:vector (mol)=3:1 (总DNA约0.5ug)
        5. ethanol 沉淀,electrotransformation, 结果得到的colony比较少,0.5ug 连接产物沉淀后, dissolve in 20ul ddH2O, 2ul + 50ul cell, spread on 8 plates, 总共只得到约1000个colonies(由于vector是单酶切,这里面还有载体自连产物,电转感受态细胞的转化效率很高,10的7次方-10的8次方),我的目的是希望尽可能cover E.coli 2kb-5kb之间的gene,所以希望能够得到5000-1w左右的colony。 但似乎电转达不到这个目的。

        我的老板给的建议是把insert用BamHI Meghylase甲基化处理,然后在T4连接过程中在连接体系中同时加入0.5unit BamHI, 18度 20min -> 20度 20min, 20 cycles,然后65度 15min酶失活处理,乙醇沉淀,电转。这个方案我正在试,还没 得到结果。还想请问对载体磷酸化是不是很必要?
        我已经反复做了一个多月了,没有突破,很是着急, 从论坛上也看到相关的帖子,如果有什么好的实验方法资料推荐,请一定多多指点。万分感谢!
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