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    技术和方案27 E.coli 感受态的制备与转化

    相关实验：酵母遗传学方法实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    H a n a h a n ”方法程序 由 Hanahan 改良自 C.Davies and M .Tibbetts (1983) 0 细胞制备 1 ) 挑 10个新鲜的£： . 单克隆接种入lm l SOB中，振荡器振勻。 2 ) 将以上悬液接种入200mlSOB+ 1 2 m l5mol/L N a C l中，置于2L 宽底烧瓶中。 3 ) 在 21〜23°C (室温为宜），中等 转 速 （275r/mm) 摇床上培养过夜。注意烧瓶要有良 好的通风透气性（ 倍增时间为2〜3h)。 4 ) 第 2 天，测定瓶中细胞密度，待 其 OD55。为 0.45〜0.55。 5 ) 冰上放置5〜lOm in冷却细胞，注意细胞置于冰上可保存较长时间。 6) 4°C下 3000〜4000r/m in离 心 lO m in收集细胞。 7 ) 加 入 20m l冰上预冷的FCB，轻柔重悬细胞沉淀。 8 ) 冰浴 15min。 9 ) 边旋涡状搅动细胞悬液，边缓慢加入700W 新鲜解冻的无水DMSO。 10) 冰浴 lOmin。 11) 如程序9 再加入700jul DMSO。 12) 冰浴 15min。 13) 将细胞分装入预冷的冷冻离心管（ 分装量为〇.5〜1. Omlh 14) 以干冰/乙醇或液氮快速冷冻。 15) 于一70°C保存细胞。， 细胞转化 1 ) 取一管上述制备的细胞，置冰上缓慢解冻。 2 ) 每 lOOpl细胞悬液中加入一份待转化DNA。 3 ) 冰浴 20min。 4 ) 约 42°C下热激90s。 5 ) 冰浴 lOmin。 6 ) 加入 lm l LB ， 37°C培养 30〜60m in。 7 ) ①全部涂板或② 4000r/m in 下 离 心 4m in，将 L B 弃去至剩余约150/J ，轻柔重悬细 胞 ，涂布于相应抗性的L B 平板上。
    材料和溶液 SOB 20g 蛋 白 胨 （2%) 5g 酵母提取物（0.5%) 0. 58g NaCl (10mmol/L ) 0. 186g KC1 (2. 5mmol/L ) 加水补至1L 以 K O H 调 节 p H 至 7.5 (大约 2 滴） 高压灭菌，使用前加入： 10ml lm o l/L MgCl2 (10mmol/L ) 20ml lm o l/L MgS〇 4 (20mmol/L ) FCB 9. 8mg 乙 酸 钾 （ lOmmol/L ) 0. 746g KC1 (lOOmmol/L ) 0. 891g MnCl2 • 4H20 (45mmol/L ) 0. 147g CaCl2 • 2H20 (lOmmol/L ) 80mg 氯化六氨合高钴（ H 价） （3mmol/L ) 10ml 甘 油 （10%) 补水至100ml 过滤除菌， 4°C保存。 注意： 购买来的无水DMS◦ 以 1.5m l/份分装，并立即于一80°C保存，待使用时取 一份解冻。 “TSS”方法程序 自Chung C.T • 等 （1989) TS S 1X 溶 液 （ 也可配成2X ) 10% (m/V ) PEG 3350 (也可使用PEG 8000,但效率稍低） 5%DMSO (V /V ) 20m m d/L Mg2+ (MgCl2 或 MgS0 4 都可使用，两者转化效率相当) p H 6. 5 ( p H 须恰好或非常接近6. 5 , 需检查确认） 制 备 化 学 法 感 受 态 的 方 法 程 序 （ 约 6 0 份 XlOO^ l/份 ） 以下是高效TSS的操作流程： 1 ) 挑选一 单克隆。 2 ) 于 5ml L B 中 37°C培养过夜。 3 ) 将 5m l上述培养物加入600m l培养基中， 生长至OD595达 0. 3〜0. 4
    4 ) 冰上冷却15m in。 5) 4°C离心收集E.coZz细 胞 （ 如对于SLA-600离心机，需 6000r/m in离 心 5min)。 6 ) 倒去生长培养基，并吸净所有培养液。 7 ) 以 6ml 1XTSS (冰上冷却）悬浮细胞。 8 ) 以 100^1/份分装量转移至1.5m l离 心 管 中 （ 管子预先孵育于一20°C为佳）。 9 ) 于干冰/M eOH浴或液氮中迅速冷却。 10) —80°C保存。 11) 测试并记录转化效率。 此 方 法 必 须 使 (DH5a) 的转化效率达到1 X 107〜5 X 107 个转化子“ g 质 粒 DNA。 制 备 “较低”效 率 化 学 法 感 受 态 的 程 序 （ 需 要 2 XTSS) 1 ) 同上文培养E.coh步 骤 1〜3。 2 ) 在 E. 生长达适当的OD595后 ，冰上冷却15min。 3 ) 菌液以1 : 1 与冰冷的2XTSS混合。 4 ) 于干冰/M eO H浴或液氮中迅速冷却。 5) —80°C保存。 6 ) 测试并记录转化效率。 预期的转化效率为1 X 106〜5 X 106 个转化子“ g 质 粒 DNA。 TS S 的 E. 在 一80°C下保存时转化效率可保持高水平，与 此 同 时 CaCl2 化学法感受态细胞一直在 一80°C下保存时转化效率会下降。 转化程序 1 ) 在冰上解冻感受态细胞。 2 ) 加入 DNA (100pg〜10ng)。 3 ) 混勻，冰上放l 〇min。 4 ) 在室温下温育l 〇min。 5) 4°C (冰上）温育 lOmin。 6 ) 加入 lm l LB ， 37°C培养 lh D 7 ) 细胞涂布于适当的选择性培养基平板上。

    来源：丁香实验

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