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        【求助】miRNA如何构建到慢病毒载体

        丁香园论坛

        3361
        miRNA如何构建到慢病毒载体?与基因构建到质粒载体有何区别吗?最好有具体的实验步骤,或相关资料,不胜感激!
        本质上没啥区别的。
        步骤:
        1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
        2、化学合成
        3、退火形成双链
        4、连接到相应载体
        5、转化感受态,
        6、酶切或者PCR鉴定,测序
        7、扩增阳性质粒,包装慢病毒,进行细胞学实验。

        其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒,现在都已经商品化了,直接买来就可以用,既节约时间,又有质量保证,何乐而不为呢?
        大鹏鸟 wrote:
        本质上没啥区别的。
        步骤:
        1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
        2、化学合成
        3、退火形成双链
        4、连接到相应载体
        5、转化感受态,
        6、酶切或者PCR鉴定,测序
        7、扩增阳性质粒,包装慢病毒,进行细胞学实验。

        其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒,现在都已经商品化了,直接买来就可以用,既节约时间,又有质量保证,何乐而不为呢?
        1.premiRNA是化学合成的吗?不是从基因组扩增?
        2. premiRNA退火形成双链是连接到什么载体?感受态?(T载体,细菌感受态行吗 )
        3.酶切后是挂到慢病毒载体上吗?
        只需要几十个碱基,不需要扩增。
        有很多市场上卖的专门用于构建miRNA的,当然是细菌感受态了
        是的
        tutufei wrote:
        1.premiRNA是化学合成的吗?不是从基因组扩增?
        2. premiRNA退火形成双链是连接到什么载体?感受态?(T载体,细菌感受态行吗 )
        3.酶切后是挂到慢病毒载体上吗?

        1、是化学合成的。如果要做pri-miRNA可以从基因组扩增,但是你只是为了表达miRNA,没必要。
        2、载体很多,比如AMBION的pSilencer 4.1,pLKo.1等等,必须是慢病毒的表达载体。感受态倒没什么限制。
        3、退火后直接连慢病毒载体,不需要酶切。当然载体是需要酶切的。化学合成的时候就是直接合成酶切后的位点,而不是完全的酶切位点。
        加我qq 2582634920
        设计miRNA的成熟体 然后连接到慢病毒载体上 应该采用什么设计方法呢 我是菜鸟 还不是很懂这方面 请大侠指点
        大鹏鸟 wrote:
        本质上没啥区别的。
        步骤:
        1、设计好premiRNA----带有相应酶切位点
        2、化学合成
        3、退火形成双链
        4、连接到相应载体
        5、转化感受态,
        6、酶切或者PCR鉴定,测序
        7、扩增阳性质粒,包装慢病毒,进行细胞学实验。

        其实不建议自己构建miRNA慢病毒质粒,现在都已经商品化了,直接买来就可以用,既节约时间,又有质量保证,何乐而不为呢?
        不知道我要设计miRNA的成熟体连接至病毒载体 该怎么设计呢 我是菜鸟 对这方面知识还不是很懂 望大侠不吝赐教
        多看文献
        我们可以做的,需要的可以联系我,QQ:24289096
        我也有问题要请教哦。

        包装慢病毒的载体,我之前包装EZH2的慢病毒,用的是plvthm这个载体,是否也可以用来包装pre-miRNA的慢病毒呢?

        是否需要使用有U6启动子的载体呢,为什么?

        pre-miRNA用哪个网站设计哦?invitrogen行么?谢谢。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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