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        细胞培养中的“黑胶虫”问题

        互联网

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        1.我们实验室最近一次的情况:
        我们前后从上海细胞中心买了三批细胞,细胞刚到的时候,观察均生长良好,密度适中,培养液清亮,也没有见小黑点,但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点,有时候在一夜之间暴长,给培养液加庆大霉素,也无济于事,对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少,但是随后几天又出现,刚开始怀疑操作有问题,但是由有经验的老师操作也出现这种问题,陆续对培养液,血清及胰酶进行培养也没发现问题。
        同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养,生长快,很快铺满,仔细观察也可以见到少量的黑点。
        后来还有从军科院过来的Hela细胞,没有使用我们的血清,直接吸出多余的培养液后,进行培养,传代后用原来吸出的培养液进行培养,同样发现了问题。
        可以发现如下的特点:
        (1) 与细胞共生,细胞长的好或密度大的话,小黑点就少,反之则 多;
        (2) 对抗生素无效;
        (3) 可能通过培养箱空气进行污染;
        (4) 单用培养液及血清培养没发现问题。
        (5) 换掖冲洗后也无效。

        以下是论坛里我找来的相关帖子内容
        “黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物,“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
        “黑胶虫”可寄生于动物细胞,也可以生存于培养基中,依靠细胞和培养基中的营养为生,并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长,开始时对细胞并没有什么影响,但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候, 细胞生长就会受到影响直至死亡,严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断,尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
        目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物,增殖缓慢但对细胞有损害,数量达到一定程度可引起细胞死亡,其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在,解决该问题是一个世界性难题
        关于是什么的问题的讨论
        A. 玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西(曾经有文献报道过)
        B. 据说这是黑胶虫,又有人说是原生动物,好象也没个统一的说法
        C. 据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫,似乎和草履虫和变形虫有类似之处,然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
        D. 有人说是纳米级的细菌

        其他的特点
        (1)形态上有些像细菌,直径约在0.5~1微米,
        (2) 在400X倒置显微镜小,有典型的布朗运动(不规则的原地小距离抖动)。
        (3) 细胞内好像也有存在,
        (4) 但并不引起培养液混浊
        (5) 时间稍长,细胞状态明显恶化,并最后死亡

        大家的处理:
        1.换好一点的血清(我觉着和血清的关系不大)。
        2.如果是贴壁细胞的话,可用无菌的PBS洗几次,可一定程度上缓解。若是悬浮的话,就不太好处理拉,可以向其中少加一点滋养细胞(从小鼠腹腔内取的巨噬细胞,这种细胞不分裂,过一阵就死掉了,做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道)。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效!还有就是实验环境要注意好,保持细胞间整个环境的洁净度。
        3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
        4.建议清理无菌室所有物品,重新灭菌,用KMnO4熏蒸,按首次使用无菌室做,细胞重新复苏,。
        5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打,冲洗干净后再加入培养液,坚持天天洗,传代时加生理盐水再离心一次,接种密度稍大一些,一段时间后,虫子就会大大减少,对细胞的生长也不会有大的影响。
        6.有材料称minocycline具有一定的作用,可以和换液结合起来使用。

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