绿色荧光蛋白基因(GFP)的免疫印迹

[实验原理]
免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（Ap）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）染色，再加酶的底物显色，通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。
为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白，本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以保持GFP的天然活性，利用荧光对其进行追踪。此外，实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体，以节省费用。蛋白A是从细菌分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白，在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。同样是为了节省费用，实验中用醋酸纤维素膜（AC膜）代替硝酸纤维素膜（NC膜），这样要便宜得多，而效果却无大差别。

第一部分：GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳，除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外，其余的与SDS-PAGE几乎相同。因为要做免疫印迹，电泳结束后，凝胶不染色，而是做转移电泳。

[ 仪器 、材料和试剂]
(一) 仪器 与器材
1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．电泳仪
3．微波炉
4．小型高速离心机
5．专用紫光灯（BIO-RAD公司）
6．枪，枪头，1.5mL 离心管
(二)材料
1．蛋白样品：GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀
(三) 试剂
1．1.5mo1／L Tris•HCl pH 8.8
2．0.5mo1／L Tris•HCl pH 6.8
3．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。
4．10％Ap (-20℃存放)
5．2x 非变性胶样品缓冲液：
0.125 mo1／L Tris•HCl pH6.8
20％ 甘油
0.01％ 溴酚蓝
6．5x电极缓冲液
Tris 7.5g
G1y 36 g
双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用

[实验操作]
1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：
2．做胶：先配制浓度为12％的分离胶，配方如下：

双蒸水 3.3 mL
1.5mo1／L Tris•HCl (pH 8.8) 2.5 mL
Acr／Big(30％) 4.0 mL
TEMED 10 μL
10％AP 100 μL
总体积 10 mL （刚好灌制两块胶）

灌分离胶胶后在胶面上加水封，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），开始配制4％的浓缩胶，配方如下：

双蒸水 1.8 mL
0.5mo1／L Tris•HCl pH 6.8 0.75mL
Acr／Bis (30％) 0.4 mL
TEMED 5μL
10％Ap 30μL
总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶）

灌浓缩胶、插1mm的梳子。待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理。 (生物秀——专心做生物！ www.bbioo.com )
3．非变性凝胶电泳蛋白样品的制作：在GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀中加2x 非变性胶样品缓冲液100微升，用枪头吹打，使沉淀溶解，将样品液转移到1.5mL离心管中，12000r/m离心3分钟，取上清液加样。
4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板"三明治"从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉，用2%融化的琼脂填满胶底的空隙，注意不要产生气泡。
5．电泳槽组装：封底后将玻璃板"三明治"凹玻璃面向内重新装到"提篮架子"上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。
6．加样：取蛋白溶液离心后的上清液加样，加成一个梯度，即每一泳道的加样量依次减半。
7．电泳：先将电压调到80V，当样品进入分离胶后，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。
8．将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，小心地用塑料牙签将凝胶从玻璃上剥离下来，使凝胶贴在事先准备好的一张比胶面略大的滤纸上。操作时要徐缓，小心不要把胶弄破。