利用绿色荧光蛋白进行免疫印迹的操作步骤

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绿色荧光蛋白（GFP）是从水母中分离得出，作为分子生物学常用的荧光标记，可以实现活细胞内基因表达和定位，对细胞无毒害作用，细胞内的GFP检测比较简单（可利用荧光显微镜 等检测），GFP在细胞生物学上具有广泛的应用前景。

[实验原理]

免疫印迹(Western blotting 或 Immunoblotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移(转移电泳)，它又有半干法和湿法之分。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原 。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶(Ap)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体)染色，再加酶的底物显色，通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。

为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白，本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以保持GFP的天然活性，利用荧光对其进行追踪。此外，实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体，以节省费用。蛋白A是从细菌 分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白，在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。同样是为了节省费用，实验中用醋酸纤维素膜(AC膜)代替硝酸纤维素膜(NC膜)，这样要便宜得多，而效果却无大差别。

第一部分：GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳，除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外，其余的与SDS-PAGE几乎相同。因为要做免疫印迹，电泳结束后，凝胶不染色，而是做转移电泳。

[仪器、材料和试剂]

(一)仪器与器材

1.垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子

2.电泳仪

3.微波炉

4.小型高速离心机

5.专用紫光灯(BIO-RAD公司)

6.枪，枪头，1.5mL 离心管

(二)材料

1.蛋白样品：GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀

(三)试剂

1.1.5mo1/L Tris•HCl pH 8.8

2.0.5mo1/L Tris•HCl pH 6.8

3.30%Acr/Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。

4.10%Ap (-20℃存放)

5.2x 非变性胶样品缓冲液：

0.125 mo1/L Tris•HCl pH6.8

20% 甘油

0.01% 溴酚蓝

6.5x电极缓冲液

Tris 7.5g

G1y 36 g

双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用

[实验操作]

1.装配做胶用的玻璃板"三明治"：

2.做胶：先配制浓度为12%的分离胶，配方如下：

双蒸水 3.3 mL

1.5mo1/L Tris•HCl (pH 8.8) 2.5 mL

Acr/Big(30%) 4.0 mL

TEMED 10 μL

10%AP 100 μL

总体积 10 mL (刚好灌制两块胶)

灌分离胶胶后在胶面上加水封，等胶自然凝聚后(此时在胶面与水封之间可见清晰的界限)，开始配制4%的浓缩胶，配方如下：

双蒸水 1.8 mL

0.5mo1/L Tris•HCl pH 6.8 0.75mL

Acr/Bis (30%) 0.4 mL

TEMED 5μL

10%Ap 30μL

总体积 3.0 mL (够做两块板的浓缩胶)

灌浓缩胶、插1mm的梳子。待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理。

3.非变性凝胶电泳蛋白样品的制作：在GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀中加2x 非变性胶样品缓冲液100微升，用枪头吹打，使沉淀溶解，将样品液转移到1.5mL离心管中，12000r/m离心3分钟，取上清液加样。

4.琼脂封底：做好胶后，把玻璃板"三明治"从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉，用2%融化的琼脂填满胶底的空隙，注意不要产生气泡。

5.电泳槽组装：封底后将玻璃板"三明治"凹玻璃面向内重新装到"提篮架子"上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。

6.加样：取蛋白溶液离心后的上清液加样，加成一个梯度，即每一泳道的加样量依次减半。

7.电泳：先将电压调到80V，当样品进入分离胶后，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。

8.将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，小心地用塑料牙签将凝胶从玻璃上剥离下来，使凝胶贴在事先准备好的一张比胶面略大的滤纸上。操作时要徐缓，小心不要把胶弄破。

第二部分：免疫印迹染色

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器与器具

1.电泳仪(要求为大电流低电压)

2.电泳转移槽及转移夹

3.水平摇床

4.小塑料盒

5.镊子

6.搪瓷盘

(二)材料

1.醋酸纤维膜

2.滤纸

3.一次性塑料手套

(三)试剂

1.转移电泳缓冲液

25mmo1/L Tris，192mmo1/L 甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3

6.05gTris + 28.83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L

2.PBS贮存液(10xPBS)

0.2mo1/L 磷酸缓冲液，PH=7.4，含8.7% 的NaCl

3.PBS缓冲液：10xPBS贮存液用重蒸水10倍稀释

4.封闭液：PBS + 5%脱脂奶粉

5.漂洗液：PBS + 0.2%Triton X-100

6.丽春红染色液：4%三氯醋酸，1%丽春红

7.一抗：兔抗GFP血清，用PBS适稀释50-100倍

8.辣根过氧化物酶标记的蛋白A (HRP-pA)

9.DAB显色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris-HCl(pH 7.4-7.6)中，然后加入50微升的0.5%的过氧化氢。显色液不稳定，要在临用前配制。

[实验操作] (接第一部分的实验操作8往下做)

1.将醋酸纤维素膜(AC膜)事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。

2.在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液，将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡，使完全浸透。同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。

3.将转移夹打开，置搪瓷盘中，在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵，把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上，在转移电泳缓冲液中使AC膜紧贴在凝胶上，切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。再把一张滤纸浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一块海绵。将转移夹合上，夹紧，做成“三明治 ”。

4.转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液，将“三明治”夹放入，使凝胶块(即黑色的一面)朝向负极，AC膜朝向正极，切勿放错方向，否则蛋白将跑到溶液中，而不是转移到膜上。

5.接通电泳仪电源，使电流达到100-150mA，电泳转移过夜。

6.转移电泳完毕，将转移“三明治”夹从转移电泳槽中取出，将夹子打开，用镊子捏住AC膜的一角，将AC膜有蛋白的一面朝上放在一块干净的滤纸上。于暗处在紫光灯下，仔细观察发绿色荧光的条带的位置，用铅笔点一些点子，标出它。

7.将AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中，加丽春红染液10-20mL，染色3分钟，用蒸馏水轻轻漂洗数次至背景红色消失。这时应该可以看到转移到膜上的蛋白条带。

8.倾去漂洗的蒸馏水，在小塑料盒中加入封闭液10mL，室温下于脱色摇床上缓慢振荡1小时。

9.倒出封闭液(弃去)，用PBS洗一次，加PBS稀释的一抗溶液5mL，室温下缓慢振动3小时或过夜。

10.取出AC膜，用PBS漂洗液洗3次，每次5分钟(手摇或脱色摇床上振荡)。

11.放入HRP标记的蛋白A溶液中，在室温下于脱色摇床上缓慢振动3小时或更长时间。

12.取出AC膜，用漂洗液洗涤，方法同10。

13.加入DAB显色液5mL，轻轻晃动，显色数分钟或更长的时间，直到黄褐色的条带清晰可见，加入蒸馏水漂洗几次，洗去显色液，终止反应。注意主要的显色条带是否与事先用铅笔标记的位置相重合。

14. 将AC膜夹在两张干滤纸中间，将水分略微吸干，然后扫描或拍照，记录实验结果。

本文采用了非变性的PAGE胶电泳，保持了绿色荧光蛋白的天然活性，有利于荧光追踪待检测的目的蛋白。此外，本实验为了节省成本，使用便宜的醋酸纤维素膜代替NC膜（对实验结果无太大影响）。