抑制剂对酶活力的影响——抑制类型的判断和抑制剂常数（Ki）的测定
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酸性磷酸酯酶动力学性质分析
抑制剂对酶活力的影响——抑制类型的判断和抑制剂常数（Ki）的测定
[原理]
抑制剂影响酶促反应的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。
（1）竞争性抑制类型：
酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km"增加，Vm"不变。（下式中Ki为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。
(2）非竞争性抑制类型：
抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km"不变，Vm"下降。
（3）反竞争性抑制类型：
抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。Km"、Vm" 都发生变化。
对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v～1/[S]作图法，求出Km"、Ki、 Vm"，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。
[方法和步骤]
取19支 试管 0～18编号，0号管为空白。各管按下表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6），摇匀。再加入l0mmol/L磷酸二氢钾0.1mL或3mmol/L氟化钠溶液0.1mL并补充0.2mol/L pH.5.6乙酸盐缓冲液至各管溶液总体积为0.6mL，摇匀，于35℃恒温 水浴 预热2min。各管计时加入稀释好的酶液0.4mL，充分摇匀，35℃精确反应15min后，加入1mol/L碳酸钠溶液2mL，再加入0.5mL Folin-酚稀溶液，继续保温显色10min。0号管内的0.4mL酶液最后加入，其它操作与无抑制剂组的第6管相同。冷却后以0号管作空白，置 分光光度计 中在680nm波长处读取各管的吸光度A680。
[结果处理]
1、计算各管[S]、1/[S]值；
2、根据各管的吸光度A680值得出相当的酚含量/μmol（参见实验三十一），计算v、1/v值；
3、分别作KH2PO4和NaF抑制剂的1/v～1/[S]曲线（有抑制剂和无抑制剂两条曲线作在同一坐标轴中），判断KH2PO4和NaF抑制剂的抑制类型；
4、计算[I]，并求出相应的抑制剂常数Ki。
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组别
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无抑制剂 |
1mmol/L KH 2 PO 4 |
0.3mmol/LNaF |
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管号
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
0 |
|
5 mmol/L磷酸苯二钠/mL
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0.10 |
0.15 |
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.50 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.50 |
0.10 |
0.15 |
0.20 |
0.25 |
0.30 |
0.50 |
0.50 |
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10mmol/L KH 2 PO 4 /mL
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各管0.1 |
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3mmol/L NaF/mL
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各管0.1 |
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0.2mmol/L乙酸盐 缓冲液 /mL
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0.50 |
0.45 |
0.40 |
0.35 |
0.30 |
0.10 |
0.40 |
0.35 |
0.30 |
0.25 |
0.20 |
0 |
0.40 |
0.35 |
0.30 |
0.25 |
0.20 |
0 |
0.10 |
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稀释酶液/mL
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各管0.4 |
0.4 （最后加入） |
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35℃精确反应15min |
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各管内分别先后加1mol/L碳酸钠溶液2mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，35℃保温显色10min |
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A 680
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磷酸苯二钠/mmol ×L -1 |
0.50 |
0.75 |
1.0 |
1.25 |
1.50 |
2.50 |
0.50 |
0.75 |
1.0 |
1.25 |
1.50 |
2.50 |
0.50 |
0.75 |
1.0 |
1.25 |
1.50 |
2.50 |
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