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        mTOR抑制剂作用法

        相关实验:PI3K/Akt/mTOR 信号通路

        最新修订时间:

        原理

        观察阿霉素(Doxorubicin,DOX)单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响,探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。

        材料与仪器

        步骤

        一、细胞表达检测

        1.  分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞,以不同浓度的DOX单用或与RAPA(20 nmol/ml)联合应用培养48 h或24h。

        2.  以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用,以流式细胞技术检测二者的凋亡情况,以 Western blot法检测者P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)的表达改变。
         
        二、细胞表达结果

        1.  0.156~2.5 mg/L浓度范围内,DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,且呈浓度依赖性;DOX在0.625~10mg/L浓度范围内,Hep3B细胞的相对存活率显著大于HepG2细胞(P<0.01)。

        2.  与DOX单用比较,DOX(0.156~2.5 mg/L)与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率(P<0.01或P<0.05),DOX(0.156~10mg/L)与RAPA联用,Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞(P<0.01)。

        3.  DOX(0.156~10 mg/L)单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生,且 随DOX浓度增加,凋亡牢升高。

        4.  与DOX单用比较,DOX(1.25~10 mg/L)与RAPA联用,HepG2细胞捌亡率较显著升高 (P<0.01或P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)与RAPA联用,Hep3B细胞凋亡率显著升高(分别P<0.05)。

        5.  DOX(5.0~10mg/L)单用,HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞(分别P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)与RAPA联用,HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞(分别P<0.01)。

        6.  RAPA(20nmol/L)、DOX(2.5mg /L)以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)表达减 少,且以DOX与RAPA联用效应最为明显。
         
        三、细胞表达结果分析

        1.  DOX可抑制HepG2和Hep3B细胞生长增殖,促进细胞凋亡,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度。

        2.  DOX与 RAPA联合用药能显著抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,促进细胞凋亡,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度,并在一定浓度范围内表 现出协同效应。

        3.  在一定浓度范围内,HepG2细胞对DOX单用或与RAPA联合用药的敏感性显著高于Hep3B细胞,可能与HCC细胞p53的表达 差异有关。
         
         

        来源:丁香实验

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