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        重组蛋白纯化的基本策略

        互联网

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        一、融合表达蛋白的纯化:

        融合表达蛋白可以在原目标分子之外带有GST肽段或(His)6肽段,从而使得可以分别用Glutathione Sepharose凝胶或Chelating Sepharose凝胶进行亲和色谱分子,一步可以达到~90%的纯度,经过特异蛋白酶切后,再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度(95~99%)。

        二、包含体表达蛋白的纯化:

        在E.coli系统表达重组蛋白,表达量高时,常形成包含体,包含体易于与细胞其他组分分离,但需要注意的是蛋白复性的步骤。一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后,用稀释的办法进行复性,也可以利用凝胶过滤色谱进行复性(已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道)。以下以rhGM-CSF(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的下游纯化工艺为例:

        E.coli细胞,超声破碎,离心收集包含体,用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白,作1:70稀释使蛋白复性,加硫酸铵至一定浓度后,上样于Phenyl-Sepharose 6 FF(high sub)色谱柱,活性组分再上Q-Sepharose FF进行离子交换,最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱,最终获得了纯度较高的rhGM-CSF,同时,DNA及内毒素去除率均很高。如下表所示:

        步骤 体积(ml)蛋白(mg)内毒素(EU/ml)DNA(pg/ml)

        起始(复性样品)4344 490 421 180

        HIC疏水柱 880 220 243 0.46

        AIEX阴离子交换 620 88 251 0.14

        GF凝胶过滤 1045 62 9 0.08

        三、周质表达的蛋白的纯化:

        可用渗透压休克方法,使周质释放,然后利用扩张床技术将含有菌体的悬液直接上柱(STREAmlINE系列凝胶),菌体穿过而表达的蛋白上柱。

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