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        重组蛋白纯化的基本策略

        互联网

        4614

        三阶段纯化策略

        纯化问题所涉及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段

        捕获阶段:目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。

        中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质,如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

        精制阶段:除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

        分离方法的选择

        根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法:

        蛋白质的性质
        方法
        电荷(等电点)
        离子交换(IEX)
        分子量
        凝胶过滤(GF)
        疏水性
        疏水(HIC)反相(RPC)
        特异性结合
        亲和(AC)


        每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。

        分辨率:由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说,当杂质和目标蛋白性质相似时,在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。

        处理量:一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。

        速度:在初纯化中是重要因素,此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。

        回收率:随着纯化的进行渐趋重要,因为纯化产物的价值在增加。

        在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表:

        技术
        主要特点
        捕获
        中度纯化
        精制
        样品起始状态
        样品最终状态
        IEX
        高分辨率
        高容量
        高速度
        ★★★
        ★★★
        ★★★
        低离子强度
        样品体积不限
        高离子强度或pH改变。
        样品浓缩
        HIC
        分辨率好
        容量好
        高速度
        ★★
        ★★★
        高离子强度
        样品体积不限
        低离子强度
        样品浓缩
        AC
        高分辨率
        高容量
        高速度
        ★★★
        ★★★
        ★★
        结合条件特殊
        样品体积不限
        洗脱条件特殊
        样品浓缩
        GF
        高分辨率
        (使用Supedex)
        ★★★
        样品体积(
        缓冲液更换(如果需要)
        样品稀释
        RPC
        高分辨率
        ★★★
        需要有机溶剂
        在有机溶剂中,有损失生物活性的风险

        提示:

        1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少,以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。

        2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法,所以HIC是捕获阶段的理想方法。

        3、GF很适宜在由浓缩效应的方法(IEX、HIC、AC)后使用,凝胶过滤对上样体积有限制,但不受缓冲液条件的影响。

        4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或/和处理量的方法

        5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下,可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。

        6、只要目标蛋白耐受的情况下,可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。

        注:应该指出,三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。

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