Western Blot实验准备与步骤

一、材料和方法

1．试剂及耗材

蛋白抽提试剂（改进型RIPA配方）

BCA蛋白定量试剂盒

5×还原样品缓冲液

10×Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液

考马斯亮蓝染色液

10×TBST pH8.0

湿转缓冲液

PVDF膜，0.22um孔径

丽春红染色液

PMSF

蛋白酶抑制剂

封闭液

ECL发光液

山羊抗兔IgG（H+L），HRP

兔抗山羊IgG（H+L），HRP

β-actin 鼠单抗

2．实验仪器

Fresco低温冷冻离心机

MultiSkan3酶标仪

电泳槽

湿转电泳槽

电泳仪

水平脱色摇床

二、 实验方法及结果

3.1细胞蛋白抽提

预冷RIPA蛋白抽提试剂（德元Cat# LY7001），加入蛋白酶抑制剂（德元Cat# LY7150）。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1×107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。

3.2 BCA法蛋白定量

准备BCA（德元Cat# LY7052）工作液 A液：B液=50:1，稀释好各个浓度BSA标准品,样品用PBS进行稀释。

每孔加样品200ul,标准品也加200ul,再加25ul,混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取OD值。用Ascent软件分析浓度值。

3.4 SDS-PAGE

3.4.1 根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。

3.4.2 待检测蛋白样品上样量：上样15ug

3.4.3 电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压160V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。

3.5转膜（湿转法）

转膜条件：300mA恒流；0.22um孔径PVDF膜，转膜时间75min。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标记，准备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。

3.6 封闭：将膜完全浸没封闭液（德元国际 Cat# LY7141）中室温轻摇60min。

3.7 一抗孵育：用TBST稀释一抗，室温孵育10min，放4℃过夜。

3.8 洗膜

第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次10min。

3.9 二抗孵育：

用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L） HRP 山羊抗小鼠IgG（H+L） HRP兔抗山羊IgG（H+L） HRP，1:5000，室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。

3.10 ECL（德元国际Cat# LY7123）加到膜上后反应2min，胶片曝光：10s-5min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2min，定影。晾片，扫描等后续分析。